震惊！空载对LNPs结构表征有影响？

脂质纳米颗粒(LNPs)作为核酸递送的多功能纳米载体，在医学领域发挥着重要作用，包括癌症免疫疗法、代谢调节和预防性疫苗等方面。典型的LNPs配方由可电离的阳离子脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇(PEG)四种脂质组成，这些成分在稳定性、结构、包封效率以及体内外相互作用中都发挥着至关重要的作用。负载了核酸的LNPs的内部结构和表面形态会随着脂质成分的不同而产生变化，从而影响终产品的稳定性和治疗效果。

为了提高核酸递送的效率，研究者已经开发了多种先进技术对装载核酸的LNPs进行结构表征，其中小角中子散射(small angle neutron scattering, SANS)通过氢和氘的中子散射长度密度差异可以揭示mRNA-LNPs中的脂质分布。然而，以往的SANS分析往往基于一个理想化的假设——即LNPs内的mRNA是均匀分布的，却忽视了可能存在空载LNPs的情况。此外，最近有研究表明，通过商业微流控技术制备的mRNA-LNPs样品中可能混有空载的LNPs。这一发现对SANS的结构数据可靠性提出了挑战，并提示我们需要对SANS的结构模型进行重新评估。

近日，来自上海交通大学的团队在bioRxiv平台发布了一篇题为“Structural Characterization of mRNA Lipid Nanoparticles in the Presence of Intrinsic Drug-free Lipid Nanoparticles”的文章，通过结合SANS和纳米流式检测技术(NanoFCM)，开发了一种在空载LNPs存在的情况下表征mRNA-LNPs结构的方法，这对于mRNA-LNPs的机制研究和质量评估具有重要意义。

一、空载LNP和mRNA-LNP样品的基本表征

研究人员采用Moderna开发的COVID-19 mRNA疫苗的脂质配方，通过包裹长度为2856 nt的mRNA制备mRNA-LNPs，并用相同的配方制备了空载的LNPs作为对照。粒径分析结果显示，mRNA-LNPs的粒径相较于空载LNPs有所增大(图1a)。此外，冷冻电子显微镜(cryo-EM)结果显示，空载LNP和mRNA-LNP样品均呈现出疱疹样形态，即近似球形但不规则的结构，且具有明显的电子密度分区(图1b)。为深入研究mRNA-LNPs的内部结构，作者进一步使用小角度X射线散射(small angle X-ray scattering, SAXS)表征两种样品。SAXS曲线显示，mRNA-LNPs相较于空载LNPs在q~0.13 Å-1处多了一个峰(图1c)，这个结果与早前的研究吻合，即mRNA分子嵌入脂质复合物后会在q~0.1 Å-1处产生一个特征峰。另外，SAXS数据没有发现mRNA水溶液的特征峰，证明本研究的mRNA-LNPs中存在脂质-mRNA混合物。结合以上结果，作者提出了mRNA-LNPs由水相和含有mRNA的脂质相组成的模型，这个结构模型与其它研究不同，大多数研究者认为疱疹状形态是由包含mRNA的水相和脂质相构成的。最后，作者评估了两种样品的包封率和体外转染效力(图1d、1e)，进一步证实了该LNP配方的高质量和有效性。

图1. 空载LNP和mRNA-LNP样品的基本表征

二、空载LNPs的结构表征

LNPs在mRNA疫苗中具有双重作用，既可作为增强免疫效果的佐剂，又可能成为免疫原引发不良反应。因此，在空载LNPs显著存在的情况下，了解LNPs的结构对于阐明mRNA疫苗的药代动力学和生物分布至关重要。作者采用超小角中子散射(very small angle neutron scattering, VSANS)技术来表征空载LNPs的结构，将空载LNP样品悬浮在不同比例的D2O/H2O溶剂中(图2a)，收集VSANS数据，确定LNP核心和壳层内的脂质分布。根据VSANS数据拟合结果，提出了空载LNPs的核心-壳层结构模型(图2b），详细确定了核心和壳层的体积分数、溶剂含量及脂质组成等参数。

图2. VSANS对空载LNPs的结构表征

三、NanoFCM检测空载LNPs的比例

为获得mRNA-LNPs的结构信息，首先需要确定mRNA-LNP样品中空载LNPs的占比。对此，作者利用NanoFCM在单个纳米颗粒水平上对LNPs进行表征。通过核酸染料标记，可在mRNA-LNP样品中同时观察到侧向散射和荧光信号，而在空载LNPs中仅检测到侧向散射信号。根据信号数量可分析mRNA-LNP样品中空载LNPs的比例，结果为27.6±2.9%(图3a)。此外，通过纳米流式的荧光定量分析功能计算出mRNA-LNPs的平均负载为2.9±0.1个mRNA分子(图3b)。需要注意的是，每个LNP中封装的核酸分子数量与其长度高度相关。对于包封较短的siRNA的LNPs，每个LNP可以封装数百个siRNA分子。而对于mRNA，当长度超过2,000个核苷酸时，推测每个LNP中封装的mRNA分子数量将少于三个。这些结果为理解mRNA-LNPs的组成和结构特征提供了重要的信息，有助于进一步优化其在基因治疗和疫苗开发中的应用。通过精确测定空载LNPs的比例和mRNA的负载，我们也能够更好地评估LNPs的制备工艺和其生物学性能。

图3. 通过NanoFCM检测LNPs的满壳率和mRNA拷贝数

四、mRNA-LNPs的结构表征

基于NanoFCM分析得到的信息，从混合样本的SANS数据中扣除空载LNPs的贡献后，得到了纯mRNA-LNPs的结构信息。结果显示，mRNA-LNPs的脂质分布、壳层厚度与空载LNPs相似，但溶剂含量更高，导致核心尺寸更大。此外，分析得出，每个mRNA-LNP中平均含有3.2±0.2个mRNA分子，这与NanoFCM测定结果一致，进一步验证了结构模型的准确性。基于以上结果，作者提出了mRNA-LNPs的精确模型（图4）。

图4. 根据 VSANS 拟合结果提出的 mRNA-LNPs 结构模型

研究意义

本文深入研究了mRNA-LNPs的结构，揭示了空载LNPs在样品中的占比及其对结构表征的影响，纠正了以往研究中可能存在的结构模型偏差。通过结合NanoFCM和SANS技术，精确地表征了mRNA-LNPs的结构，为深入探究其组装机制、稳定性及与生物分子的相互作用提供了重要信息。这些研究成果有助于优化LNP的脂质配方和制备工艺，提高mRNA的包封效率和细胞内递送效率，增强疫苗的免疫原性与安全性，降低潜在的不良反应，从而加速mRNA疫苗的开发和应用。同时，对mRNA-LNPs结构的深入理解也为基因治疗领域提供了新的思路，有助于提高基因递送效率，拓展应用范围，促进纳米医学的发展，为设计更有效的纳米药物载体提供理论依据和技术支持。

展望

随着核酸纳米药物产业的不断发展，空载LNPs占比（即空壳率）已逐渐成为其工艺开发和质量控制的关键指标。对此，NanoFCM提供了一种快速、高效、高灵敏的解决方案，可在单个LNP水平快速获得样品的粒径分布、颗粒浓度、空壳率、包封率和单个LNP载荷（核酸拷贝数）等信息。如有兴趣进一步了解，欢迎联系我们获取详细解决方案。