福流生物
慢病毒解决方案
Author: Mika Huang Date: July 1, 2022
慢病毒无标记测定
NanoFCM可在单颗粒水平无标记对慢病毒的粒径和浓度进行分析，得到慢病毒样品中总颗粒浓度为3.17E11 particles/mL，粒径为86.0±19.7 nm。同时，慢病毒样品的梯度稀释结果表明，NanoFCM对慢病毒这种不均一的样品也具有非常好的线性相关（R2=0.9948）。
图1. 慢病毒粒径、浓度和稀释线性测试
慢病毒结构及组分分析
在临床应用中，慢病毒作为基因治疗的载体，相关制剂的纯度和质量均需符合GMP标准。而慢病毒生产过程中会引入非病毒成分的杂质（如细胞碎片、蛋白聚集体）和病毒成分的杂质（如空壳病毒、游离RNA等）。因此，在生产过程中以及最终产品的慢病毒产品进行多维度的定量分析必不可少。
- 膜染料测定纯度
- 核酸包装效率分析
- 慢病毒膜内蛋白p24测定
经膜透化试剂处理和抗体标记，NanoFCM可对慢病毒荚膜内部的蛋白进行定量分析，从而实现p24等慢病毒内部蛋白的检测。下图显示的是该慢病毒样本中，p24阳性率仅为55.1%，结合上述荚膜和核酸染色的数据揭示并非所有的慢病毒颗粒均有p24蛋白的表达。
图2. 红光膜染料标记的慢病毒纯度
图3. 核酸染料标记的慢病毒纯度
- 具有侵染能力的慢病毒纯度测定
功能性慢病毒测定
NanoFCM可在单颗粒水平对含有核酸和VSV-G的功能性慢病毒进行快速高通量表征。如下图，通过对慢病毒样品进行核酸和VSV-G蛋白荧光标记，NanoFCM仅需要 2-3 min就可以区分完整病毒、空壳、游离核酸等不同结构。
图4. 功能性慢病毒颗粒检测
慢病毒核酸、蛋白、荚膜的共定位分析
NanoFCM的多参数表征优势：散射通道和多色荧光通道，在单颗粒水平实现核酸、膜蛋白、内部蛋白、质膜等组分间的共定位分析，可满足其他应用场景的表征需求。
图5. 慢病毒p24和VSV-G组分共定位分析
慢病毒滴度测定比较
慢病毒滴度测定常通过ELISA对p24进行定量分析进而计算出慢病毒物理滴度，或通过侵染活性测试确定转导滴度。与p24定量方法相比，NanoFCM可直接测定慢病毒的颗粒浓度，通过对荚膜内p24蛋白的标记，实现p24阳性的病毒颗粒的定量分析。进一步通过核酸和VSV-G标记，发展了对功能性慢病毒进行快速定量分析的方法。图6为基于NanoFCM发展的慢病毒定量分析方法与转导滴度的结果对比，结果表明该慢病毒的particle-to-PFU ratio*为100以上，这个结果与ELISA的p24定量方法吻合（每个TU包含100-1000个颗粒）。
图6. 慢病毒滴度测定
工艺流程优化
慢病毒生产纯化过程涉及粗提液、过滤、酶切、离子交换、切向流过滤、浓缩、除菌等环节。NanoFCM可对慢病毒的工艺流程进行质量监控，如下图是慢病毒生产纯化过程中不同环节转导滴度（红色）、物理滴度（蓝色）的变化情况，二者的趋势非常吻合。基于NanoFCM的方法可以实时监测纯化关键流程，优化生产工艺和参数。除了对工艺流程中功能性的慢病毒进行监控，更重要的是可以分别跟踪不同处理环节对核酸或VSV-G等精细病毒组分的影响，摸索最佳的纯化工艺。
图7. 慢病毒生产过程滴度测定
