CDE 发文：预防用 mRNA 疫苗脂质纳米颗粒质量研究

核酸药物历经几十年的发展，始终受限于递送系统这一关键技术瓶颈。脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）技术的研发极大地推动了核酸药物的发展。新冠疫情期间 mRNA 疫苗的大放异彩更是将核酸药物的研发和产业化推向了前所未有的高度。尽管 mRNA-LNP 的制备工艺步骤简单、周期较短，但短短几分钟内就可能存在复杂的相变。近年来，国内外监管机构相继发布了 mRNA 疫苗的技术指南，如国家药品监督管理局药品审评中心于 2020 年 8 月发布《新型冠状病毒预防用 mRNA 疫苗药学研究技术指导原则（试行）》，世界卫生组织（World Health Organization, WHO）2021 年 12 月发布的“Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations”，美国药典（USP）于 2022 年 2 月发布了题为“mRNA 疫苗质量分析方法”的指南草案等，初步建立了 mRNA 疫苗的质量评价标准。

1999 年 3 月，国际人用药品注册技术要求协会（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use, ICH）为了协调欧盟、美国、日本等主要市场的监管标准，减少研发和审批壁垒，制定了《质量标准：生物技术产品及生物制品的检测方法和验收标准》，作为生物技术药物的指导原则，简称 ICH Q6B。ICH Q6B 对于生物制品强调了生产工艺全过程控制，同时认为，在质量标准中纳入哪些质控项目需要根据产品工艺特点、特性特点及其与安全有效性、质量可控性的相关性予以确定。国家药品监督管理局药品审评中心研究团队根据 ICH Q6B 理念，发表了《预防用 mRNA 疫苗脂质纳米颗粒质量研究及质量控制药学评价的考虑》，从药学评价角度对上述结构特点、变化趋势等进行初步探讨，对结构特征需要额外开展的研究工作提出建议，希望为预防用 mRNA 疫苗研发、生产及产品质量提升提供借鉴。

研究建议

一、粒径分布和颗粒浓度

粒径大小是决定纳米药物的半衰期和在体内分布的关键参数，粒径较小的纳米药物更可能会逃脱吞噬细胞的摄取。药用脂质体的颗粒尺寸一般不大于 100  nm，尤其是在肠胃外给药的情况下。此外，颗粒浓度作为纳米药物分析中另一个非常重要的参数，直接影响产品的给药剂量和治疗效果。

本文研究建议：采用多种检测方法对关键指标进行研究，例如：粒径检测，除常规的 DLS 法，建议采用 NTA、电镜计数、凝胶色谱、纳米流式等方法以及总粒子计数等方法。

NanoFCM 可在单颗粒水平实现纳米药物的粒径分布和颗粒浓度的无标记分析，通过灵活的圈门策略能够定向圈出特定粒径范围内颗粒的分布和占比情况。如图 1 所示，LNPs 样本的粒径分布为 40-150 nm，平均值 84.1 nm；通过单颗粒计数方法标定该样本中颗粒浓度为 2.67E+12 particles/mL。

图1. mRNA LNPs 的粒径和浓度分析

图2. mRNA LNPs 的浓度梯度稀释曲线

二、mRNA 空载体数

在 mRNA-LNP 的制备过程中，部分脂质可能未能成功包封 mRNA，形成空载体。这些空载体的存在会影响 mRNA 的封装率和递送效率。

本文研究建议：开展制剂过程中不同阶段（如包封、pH 调整及超滤等过程中）产物不含 mRNA 的空载体数、颗粒数及颗粒浓度、脂质成分均匀性等研究。

NanoFCM 可以通过荧光标记等手段，区分包封了 mRNA 的颗粒和空载体。mRNA LNPs 颗粒通过探测区时，同时产生侧向散射 SS 和荧光 FL 信号，有 SS 信号无对应的 FL 信号的颗粒为空的 LNP，在二维散点图中，mRNA LNPs 和空载 LNPs 清晰地分成两个群体（图3）。基于纳米流式检测技术仅需 1 min 即可实现 mRNA-LNPs 样本中空载率的准确定量，且经过梯度稀释验证线性良好，证明结果的准确性（图4）。此外，mRNA LNPs 空载率检测已被纳入石药集团的创新技术。（详见往期文章：《重磅|石药集团发布 mRNA-LNPs 的创新制备方法》）

图3. NanoFCM 对 mRNA-LNPs 的空载率表征

图4. mRNA LNPs 的装载率实测与理论线性关系

三、mRNA 在 LNP 分布位置

本文研究建议：可开展制剂过程中不同阶段（如包封、pH 调整及超滤等过程中）产物 mRNA 在 LNP 中分布位置的拓展性、探索性研究。

通常大家认为 mRNA 要么被包封在 LNP 里面，要么游离在溶液中，有没有第三种形态存在呢？NanoFCM凭借卓越的单分子荧光检测技术给出了颠覆性答案——mRNA 竟会“黏”在 LNP 表面！通过创新的核酸染料标记策略，首次揭示了 mRNA-LNP 体系的五种存在形态：游离 mRNA、空壳 LNP、包封 LNP 以及表面吸附 mRNA 的 LNP。NanoFCM 基于跨膜及非跨膜核酸染料对 mRNA 疫苗进行标记，并结合 RNase 处理策略以实现疫苗样本中 mRNA 分子的精准定位分析。图5详细概括了通过不同的标记策略来进行核酸定位分析，相关人员可以采用同样的标记策略对 mRNA LNPs 进行核酸定位分析，进而优化制剂配方和下游工艺流程，尽可能最大化地实现 mRNA 的有效装载，获得高纯度、高装载效率的 mRNA LNPs 产品。

图5. 核酸定位分析

四、包封率检测

本文研究建议：包封率检测，除常规使用的 RiboGreen 法，建议采用不同或互补的检测方法，如超速离心、超滤、凝胶色谱等进一步确证，在确证研究中采用不同条件包括极端条件处理后的产品以验证相关检测方法的适用性和产品的降解途径等。

NanoFCM 在单次上样中同时获得游离 mRNA 与 LNP 包封 mRNA 的荧光信号。基于荧光强度与核酸分子的拷贝数成线性正相关关系，直接定量分析每个纳米颗粒内 mRNA 拷贝数。根据药典中关于包封率的定义，NanoFCM 可以快速计算包封率。NanoFCM 专业版的软件能够一键生成核酸拷贝数和包封率的结果，以极致的时间与样本利用率，重新定义纳米样品检测的生产力标准（图6）。

图6. NanoFCM 对 mRNA-LNPs 的核酸拷贝数和包封率表征

展望

本文对 mRNA-LNP 质量研究的建议为疫苗的研发和生产提供了明确的方向。NanoFCM 凭借其独特的优势，可在单颗粒水平实现核酸药物粒径分布、颗粒浓度、空壳率、药物包封率及核酸定位等参数的定量分析。通过 NanoFCM 的应用，研究人员可以更全面地了解 mRNA-LNP 的质量属性，优化生产工艺，提高疫苗的安全性和有效性，为 mRNA 疫苗的研发和临床应用提供有力保障。