JEV文献解读：一种新型的工程化EVs制备技术的研发过程

细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)作为细胞间通讯的重要媒介，具有优异的生物相容性、低免疫原性和组织趋向性，在心血管疾病、自身免疫综合征、神经退行性疾病和癌症等在内的多种疾病研究中展示出应用潜力。然而，诸如缺乏低成本、自动化、大规模制备的方法等因素，严重限制了EVs的生物医学应用。

近期，来自天津大学、中科院化学所和浙江肿瘤医院的研究人员开发了一种大量制备脱水诱导细胞外囊泡(dehydration-induced extracellular vesicles, DIMVs)的新方法。该方法无需引入潜在的有毒物质，在30 min内即可大量制备DIMVs，具有快速、通用、可实现EVs规模化制备等优势，进一步对DIMVs的免疫原性及安全性、抑制肿瘤形成和复发能力及其在药物递送研究中的应用潜力进行探究。该成果发表在Journal of Extracellular Vesicles上。

一、DIMVs的制备与表征

作者通过脱水方式代替其他物理和化学方法以刺激细胞释放更多的囊泡。如图1所示，对经PBS洗涤后的细胞进行短时间脱水处理(20 min)，随后对脱水处理的细胞通过再水化过程，即分别添加PBS和培养基，在30 min内处理后细胞大量分泌微米级DIMVs，采用简单离心即可从上清液中收获DIMVs。作者进一步应用转染绿色荧光蛋白的HEK293T和PC9细胞在荧光显微镜下监测DIMVs的形成过程，验证了DIMVs的发芽，膨胀和脱离行为。

结合显微成像和流式细胞术等分析方法，作者进一步确认了DIMVs是一类具有生物膜结构的微米级囊泡(2~40 mm)，且在4 ℃条件下可稳定保存7天。在最佳制备条件下，每个细胞平均可产生20个DIMVs。每100万个细胞中所得DIMVs的蛋白含量可达57 mg，是相同培养条件下所得sEVs的580倍，在蛋白质利用方面具有显著优势。

图1. DIMVs的制备流程示意图

二、DIMVs与亲本细胞和相同来源sEVs的组分差异

作者进一步对DIMVs、sEVs和亲本细胞的组分进行分析，以表征三者在蛋白、DNA和RNA组分方面的差异（图2）。SDS-PAGE和定量蛋白质谱结果均显示DIMVs的蛋白质组与亲本细胞更为相似；而WB结果则显示DIMVs具有sEVs经典标志蛋白CD9、CD63和CD81的同时，也具有sEVs的阴性蛋白calnexin与GM130。这些数据表明DIMVs很可能兼具了sEVs和细胞蛋白组成的双重特征。DNA分析结果则显示DIMVs和sEVs中均不存在完整的基因组片段，且DIMVs中DNA含量最低，可以有效避免下游应用中cGAS-STING信号通路的激活；RNA分析结果则显示sEVs中的RNA含量最低，且基本均为短片段，而DIMVs则显示出最高的RNA含量，并且能够有效地装载长片段RNA，对于有效递送治疗性长片段RNA具有天然优势。

图2. DIMVs、sEVs及其亲本PC9细胞的组分比较

三、利用DIMVs制备类sEVs颗粒

不同大小的囊泡在体内具有不同的组织分布和代谢特征，因此调整囊泡的大小以适应各种临床需求至关重要。在此，作者配合使用微型挤出器和微尺度过滤技术，以生产制备类sEVs颗粒。即将DIMVs连续挤压通过1、0.4和0.1 μm的滤膜，将其制备为粒径50~200 nm的小囊泡（图3）。该方法所得类sEVs的产量明显优于从细胞培养上清中所得sEVs的产量，其颗粒数量增加50倍，且该类sEVs在没有冷冻保存剂的条件下，可稳定冻存于-80 ℃下。在细胞摄取实验中，类sEVs和sEVs显示出相当的溶酶体定位和细胞摄取能力，即表明这两种类型的颗粒可能利用相同的细胞摄取途径。

图3. 基于DIMVs的类sEVs的制备、表征及细胞摄取能力考察

四、DIMVs蛋白工程化及核酸药物装载

蛋白组数据显示DIMVs可以从亲本细胞中继承绝大多数的非细胞核蛋白，因此，在DIMVs中蛋白工程化中很可能不需要通过与支架蛋白融合来产生特定蛋白的装载。为了进一步验证该猜想，作者分别在亲本细胞的细胞膜、细胞质以及细胞内膜蛋白mScarlet-I上分别表达GFP荧光蛋白，并采用共聚焦显微镜和流式细胞术对所得DIMVs进行表征。流式结果显示三种转染细胞所得DIMVs中约40%有GFP荧光蛋白信号，且共聚焦显微镜揭示了DIMVs的靶蛋白继承了其在亲本细胞中的定位特征。因此，在基因工程方面，DIMVs有效地规避了当前sEVs基因修饰过程的局限性。

纳米流式结果进一步发现由来源于细胞膜表达GFP亲本细胞来源的DIMVs制备的类sEVs中表达目标蛋白GFP的比例为30.8%，远高于细胞分泌的sEVs 5.13%的阳性率（图4d）。综合结果表明，与传统的sEVs相比，DIMVs的蛋白货物在基因工程化改造方面具有天然优势。

作者进一步考察了DIMVs在核酸递送中的能力。之前已有文章报道，可采用末端修饰胆固醇的方式将目标核酸锚定在细胞膜上，进一步实现分离囊泡内膜的核酸修饰。因此，作者评估了在胆固醇修饰与否两种情况下DIMVs的DNA装载能力（图4e）。无论胆固醇修饰与否，DIMVs都能有效地装载目标核酸分子，效率可达100%（图4f）；含有固醇的DNA分子主要集中在DIMVs的脂膜上，而不含固醇的DNA分子则集中在DIMVs内腔（图4g）；且降低培养温度可显著降低无胆固醇DNA在DIMVs中的富集比例和富集强度（图4h）。且纳米流式检测技术分析结果表明固醇转载DNA的DIMVs所得类sEVs中成功装载目标核酸的比例可达41.3%。

综上，无论是DIMVs或者基于DIMVs所得的类sEVs在高效装载蛋白和核酸方面均具有巨大潜力。

图4. DIMVs作为蛋白和核酸递送载体分析

此外，作者也通过小鼠体内实验对DIMVs的安全性进行评估。体内成像分布显示DIMVs在小鼠体内对肿瘤具有较好的归巢效应，能在肿瘤部位进行有效富集；同时，作者还探讨了DIMVs在B16黑色素瘤的形成和复发中的抑制效果，以及其作为肿瘤疫苗的应用潜力。

展 望

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