JEV重磅：新型外泌体支架蛋白的发现

外泌体是细胞分泌的纳米级囊泡，它们在细胞间通讯中扮演着关键角色，并参与多种生理和病理过程。外泌体不仅携带蛋白质、脂质以及核酸等生物分子，还具有穿越多种生物屏障等能力，为靶向药物递送和基因治疗提供了一个全新的平台。外泌体工程化技术经由基因改造或化学修饰等手段提高外泌体的生物活性、稳定性以及靶向性，在外泌体药物递送及治疗应用中具有重要应用前景。其中通过基因工程方式作为内源性工程化外泌体改造的重要方式，在工程化外泌体的开发中备受关注。

近日，北京恩泽康泰生物科技有限公司在外泌体工程化改造领域取得重大进展，其研究成果发表于Journal of Extracellular Vesicles。这一发现拓宽了外泌体支架蛋白的选择范围，为外泌体在药物递送和基因治疗中的应用提供了新的可能性。

研究背景

由于外泌体能够调节受体细胞的生物表型，大家越来越关注其作为新型治疗载体的潜力。外泌体具备免疫原性有限、毒性低和跨越血脑屏障能力等优势，可保护封装的货物分子以及体内循环系统的稳定性，克服了合成药物递送系统的局限性。但外泌体的临床应用也面临诸多挑战，如给定生物分子含量低、循环时间短、肝脏主导的生物分布等。此外，量产工艺不成熟和缺乏完善的质量控制标准也限制了其发展。为了克服上述的问题，科研人员通过基因工程或化学修饰对外泌体进行工程化改造，以改善其生物活性、载药能力和靶向性等。改造方法之一是将目标蛋白(protein of interest，POI)通过与支架蛋白融合的方式导入外泌体，实现生成前的蛋白质改造或内源蛋白质改造。这种方法可以实现稳定大批量制备，并根据需要将POI展示在外泌体的表面或内部。目前，常见的外泌体支架蛋白分为三类，分别是四跨膜蛋白(CD63，CD9，CD81等)、膜周蛋白(MFGE8)，以及I型跨膜蛋白(Lamp2b，PTGFRN等)三类。但这些支架蛋白仍存在不足，如四跨膜蛋白的N端和C端均位于膜内，当需要在外泌体的表面展示POI时，只能对外表面的loop结构进行融合改造，加大了分子设计和验证的难度；膜周蛋白MFGE8与膜表面蛋白的结合力弱，一旦融合分子量较大的POI后，在外泌体上的含量就会迅速降低；Lamp2b适合N端融合，C端融合则会影响其分拣能力。为了让外泌体工程化改造技术能够更好地服务于外泌体创新疗法的开发，筛选新型支架蛋白的努力从未停止。而此前筛选外泌体支架蛋白的标准主要包括以下四点：

在外泌体上的高水平表达；
较小的分子量；
具有适合的改造位点；
本身不应具有明显的生物学功能。

然而，能够同时满足上述四个条件的候选蛋白数量有限。因此，本文的研究者在此研究策略之上，将支架蛋白的筛选标准进行了大幅度的精简，从之前的四个减少到以下两个：

必须是具有外泌体主动分拣能力的I型跨膜蛋白；
.在该蛋白的N端以及C端进行截短或融合等改造不会显著影响该蛋白向外泌体分拣的能力。

一、PLXNA1的筛选与鉴定

研究者首先通过高分辨蛋白组学技术对EV中不同蛋白质的分拣能力进行了初步评估。结果显示，丛蛋白A1(PLXNA1)与经典的外泌体富集蛋白(MFGE8、CD81、PTGFRN以及SDCBP等)类似，其相对丰度在细胞裂解液(CL)、初纯外泌体(UC)和高纯外泌体(DGC)之中依次呈现出由低到高的趋势，而与外泌体样本中常见的污染蛋白(CANX)呈现出相反的趋势(图1c)。并且其在外泌体中的富集程度相较于细胞裂解液有了显著提升，其增加的倍数在所有比较的外泌体富集蛋白中排名第二，仅次于MFGE8(图1d)。且该结果得到Western Blot(WB)验证(图1e)。这些结果表明PLXNA1满足了研究者设定的第一个筛选标准，即具有外泌体主动分拣能力的I型跨膜蛋白。

图1. PLXNA1的筛选与鉴定

二、NanoFCM和WB作为评估支架蛋白EV分拣能力的有效方法

为了评估PLXNA1是否满足筛选标准的第二个要求，研究者开发了一种基于WB和纳米流式的方法来评估候选支架蛋白的EV分拣能力。WB是从整体水平上对样本蛋白进行检测，而NanoFCM则是在单颗粒水平上检测蛋白阳性率以及平均荧光强度(MFI)。这两种方法的结合有助于全面评估PLXNA1的EV分拣能力。作者将GFP与支架蛋白CD63和MFGE8分别融合表达，通过ELISA和WB评估GFP蛋白分别在EV和CL中的含量以及比值。结果显示两种方法的结果是一致的，且GFP-CD63的富集程度略高于GFP-MFGE8(图2b,c,d)。而与之不同的是，NanoFCM的MFI结果表明，GFP-MFGE8优于GFP-CD63(图2e,f)，这是因为GFP MFI反映了融合蛋白的EVs中的表达，而与细胞中可能残留的融合蛋白的数量无关。

图2. PLXNA1的EV分拣能力评估

三、PLXNA1截短和融合不影响外泌体的分拣能力

按照前述的筛选标准，PLXNA1作为外泌体支架蛋白仍存在天然劣势。首先，其N端和C端各有一个具有生物学功能的结构域；其次，该蛋白的分子量较大，约为211kDa。所以全长的PLXNA1并不适合作为外泌体支架蛋白。于是研究者对PLXNA1进行了五种不同形式的截短，并且在N端和C端与不同的货物分子(即IL 12和GFP)进行融合改造，结果显示该蛋白的多个截短体均保持了较高的外泌体分拣能力(图3a,b,c)。这说明PLXNA1也同样满足筛选标准的第二条要求，即支架蛋白的N端以及C端进行截短或融合等改造不会显著影响该蛋白向外泌体分拣的能力。

图3. 截短的PLXNA1保持了较高的EV分拣能力

四、PLXNA1截短体作为外泌体支架蛋白的优势

为进一步阐明PLXNA1截短体在EV分拣中的优势，研究者将PLXNA1截短体与另外两种广泛认可的I型跨膜支架蛋白(Lamp2b和PTGFRN)进行了头对头的比较，在HEK293和MCF-7细胞系中PLXNA1截短体均展现出了明显的载量优势(图4)。

图4. PLXNA1截短体相较于已知支架具有优势

研究者进一步设计实验来验证POI在EV表面和腔内的活性。研究者首先将PLXNA1(863-1316)和核糖体蛋白L7AE进行融合，并与目标mRNA(带有C/D盒序列的NanoLuc mRNA)共转染到293F细胞中，然后将产生的EV与HepG2细胞共孵育，以测试融合表达是否会影响L7AE的RNA结合能力。孵育实验发现，NanoLuc-L7AE-EV处理的细胞中，NanoLuc mRNA水平显著上调，且NanoLuc催化活性比用NanoLuc-EV处理的细胞高出四倍，表明L7AE工程化EVs在递送目标mRNA方面具有优势(图5b)。此外，若siRNA技术干扰表达下，NanoLuc-L7AE-EV处理的细胞活性降低了30%，进一步证实了受体细胞中的NanoLuc催化活性来源于mRNA的成功递送(图5c)。

进一步的实验中，研究者将NanoLuc蛋白直接融合并表达在PLXNA1(863-1316)的C端，体外实验也表现出剂量依赖性的底物催化活性(图5d)。同时，将小鼠IL12(mIL12)与PLXNA1的N端融合，发现重组mIL12(rmIL12)和mIL12修饰的EVs(EVmIL12)体外实验中引发的IFN-γ激活水平相同(图5e)。这些结果表明，无论是与支架蛋白的C端还是N端融合，对蛋白质货物的功能影响有限。

最后，在携带MC38肿瘤的小鼠模型中，比较了rmIL12和EVmIL12对肿瘤生长抑制活性的影响。结果显示，EVmIL12在相同剂量下比rmIL12表现出更有效的肿瘤生长抑制活性，并且治疗效果呈剂量依赖性(图5f,g)。这些数据综合表明，融合到外泌体中的PLXNA1截短片段的POIs保持了甚至比重组POIs更强的活性。

图5. 融合PLXNA1截短体的POIs活性评估

五、基于ALFAtag/NbALFA的通用外泌体平台

研究者构建了一个基于ALFAtag/NbALFA系统的通用外泌体平台(图6a)。通过将NbALFA纳米抗体融合表达在PLXNA1的N端，实现了带有ALFAtag标签的重组蛋白与外泌体的高效结合。这种标记方法不仅效率高(图6b,c)，也不影响POIs的活性(图6d)。此外，研究者还评估外泌体的保存过程中的稳定，结果表明基于NbALFA/ALFA系统的工程外泌体可以抵抗至少三次冻融，且能够在多个条件下长时间稳定保存(图6e,f)。由此说明，这种NbALFA/ALFA系统是一种高度通用和稳定的外泌体工程技术。

图6. 基于ALFAtag/NbALFA系统的通用外泌体平台的评估

研究意义

该项研究对外泌体支架蛋白的筛选条件进行了修订和拓展，为外泌体递送系统的开发带来了更多的可能性，且筛选得到的支架蛋白PLXNA1并在对其进行截断改造的基础上实现了高表达、高活性、高递送能力和高稳定性的工程化外泌体。此外，恩泽康泰构建的通用型外泌体开发平台ALFAtag/NbALFA，为工程化外泌体后续作为药物载体的应用潜力提供了有力证明。该研究成果标志着外泌体技术在药物递送和基因治疗领域迈出了重要的一步，推动了工程化外泌体未来的临床应用和产业转化。

展望

NanoFCM不仅可对EVs的颗粒浓度、粒径分布、载药量、蛋白、核酸等物理生化性质进行分析，还对EVs的生产过程进行质量控制，优化生产条件、提高载药效率。同时可对EVs在生产后的稳定性进行评价，评估不同存储条件对EVs的影响。NanoFCM的应用贯穿整个EVs制剂研发、大规模生产、分离纯化、质控、稳定性评估等整个过程，极大加速EVs产品研发和产业化进程！