线粒体

HIGH-THROUGHPUT MULTIPARAMETER ANALYSIS OF INDIVIDUAL MITOCHONDRIA

Author: admin     Date: August 25, 2021

线粒体是细胞的能量工厂,在真核细胞的进化中发挥着重要作用。此外,线粒体还与细胞内信号转导密切相关,如自噬、细胞死亡、自然免疫等。多种复杂的人类疾病都是由线粒体的功能异常导致的,包括神经退行性疾病和新陈代谢紊乱。因此,线粒体研究对于基础生命科学研究意义重大。线粒体的结构微小,且不同线粒体之间存在较大的异质性(heterogeneity), 它的直径一般为0.5-1.0 μm,长度为1.5-3.0 μm。散射光强度与100-200 nm聚苯乙烯微球相当,生化物质含量较低,单个线粒体的检测一直以来都是一个富有挑战性的课题。迄今为止,虽然流式分析在单个线粒体的分析领域占据主导地位,如采用流式细胞仪对线粒体的纯度、膜电位、钙离子诱导后的形态变化,活性氧(ROS)等进行了检测,然而线粒体分析仅局限于能够被高亮度荧光染色的生化参数,纳米流式检测仪灵敏度的大幅提升将为单线粒体分析提供先进的表征技术。

1. 线粒体纯度和结构完整性的快速表征

在纳米流式检测装置上,分别采用NAO和SYTO 62 对线粒体内膜上的心磷脂和基质中线粒体核酸(mtDNA)进行特异性标记,通过对单个线粒体的散射、内膜心磷脂、mtDNA的同时检测可实现线粒体的纯度和内膜结构完整性的考察;通过外膜穿孔蛋白(porin)蛋白和膜间隙cyt c蛋白的同时检测能够对线粒体的外膜和功能的完整性进行快速表征。

Anal. Chem. 2012, 84, 6421-6428.

2. 膜电位检测与靶向线粒体抗癌药物的筛选

以线粒体为靶点的抗癌药物能够通过引发线粒体外膜通透性的改变直接启动细胞凋亡进程,规避细胞耐药机制,是抗肿瘤靶向性药物设计的新途径。采用线粒体膜电位探针DiOC6(3)对线粒体进行荧光染色,通过测定药物作用前后线粒体膜电位、内部颗粒性以及完整线粒体数量的变化,发展靶向线粒体抗肿瘤药物的快速筛选方法,准确地鉴定药物能否直接作用于线粒体以及作用的强弱程度。氰基-对-氯苯腙(CCCP)能有效导致线粒体膜电位下降,作为阳性对照。

 药物浓度度对线粒体膜电位的影响

Anal. Chem. 2014, 86, 5232-5237.

 

3.单线粒体水平蛋白拷贝数及其分布的测定

线粒体通过其表面或内部的各种蛋白直接参与并调控多种细胞生命活动,对线粒体的各种蛋白进行快速、准确的定量表征有助于研究线粒体的作用和调控过程。对线粒体蛋白进行免疫荧光标记,借助荧光当量已知的荧光标准球,可以获得单个线粒体Bcl-2家族蛋白的拷贝数及其统计分布。

单个线粒体Bcl-2拷贝数的定量检测

Biosens. Bioelectron. 2015, 74, 476-482.