mRNA递送系统 —— LNP or 外泌体？

Author: Mika Huang Date: April 19, 2022

在新冠疫情全球大流行的背景之下，mRNA疫苗一战成名。辉瑞和BioNTech合作开发的Comirnaty (BNT162b)在2021年销售收入403.4亿美元，Moderna的Spikevax (mRNA-1273)收入176.75亿美元。近日，政府层面多次提及mRNA疫苗，国内企业研发进度加速，康熙诺生物、石药集团、沃森生物/艾博生物、斯微生物、艾美疫苗等企业研发的新冠mRNA疫苗均已处于不同的临床阶段。未来的十年将是mRNA行业蓬勃发展的大时代。

mRNA疫苗是核酸药物的一种，核酸药物从基因水平对患者进行治疗，只需针对目的基因开发合适的序列，即可开发相应药物，避免了研发过程的盲目性。核酸分子在体液循环系统中易被降解，具有免疫原性，易被富集于肝脏等器官。目前核酸药物递送最常用的是脂质纳米颗粒（lipid nanoparticle, LNP）载体，但其存在潜在的细胞毒性、无法靶向特定组织、细胞摄取效率低等不足，因此如何在保证安全性的前提下将核酸分子成功、有效地递送到特定的组织器官仍然具有挑战性。

外泌体作为新型纳米药物递送系统，一经发现就备受学术界和工业界关注。外泌体作为递送载体具有诸多优势，如：
1.通过工程化修饰，可靶向到特定的组织和器官，解决传统递送系统无法解决的问题；
2.无免疫原性，包裹的核酸药物不易降解，降低药物全身暴露毒性；
3.可跨越血脑屏障，实现颅内药物递送。基于以上特点，外泌体结合核酸疗法已成为新的热点。
目前，美国Codiak Biosciences公司的exoASO-STAT6外泌体核酸药物已进入I期临床试验，通过在外泌体表面携带反义寡核苷酸（ASO），降低免疫抑制转录因子的表达，促进抗肿瘤免疫反应。英国EVOX Therapeutics通过其自主研发的DeliverEX^TM平台开发装载mRNA和siRNA外泌体的产品，期待在罕见病和神经类疾病的治疗上有所突破。

外泌体向人们展示了其在核酸药物递送中无可比拟的优势。由于外泌体本身也含有核酸分子，影响着受体细胞的生理状态。因此在递送核酸药物之前，对外泌体自身运载核酸分子的解析显得尤为重要，这将为外泌体的核酸递送的发展提供切实可靠的指导意义。小编给大家分享一篇文章，大家可以思考一下对于当红的mRNA疫苗如果基于外泌体来递送是不是更具优势？

近日，厦门大学颜晓梅教授课题组在Journal of Extracellular Vesicles（IF = 26）在线发表题为“Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry”的研究论文，在单颗粒水平对EVs的DNA进行综合表征，分析了EVs携带的DNA种类、含量、分布等情况，有望为外泌体核酸载药奠定基础。该研究利用NanoFCM结合SYTO 16核酸染色和酶消化策略对EVs和DNA进行全方位表征，发现：

超离获取的EVs样本中含有大量游离的DNA，单个EVs中EV-DNA的含量表现出很大的异质性，根据细胞类型的不同，DNA阳性EVs（DNA⁺EVs）的比率占总EVs的30% – 80%；

图1.EVs中DNA的分布情况

EVs中的DNA主要是双链DNA（dsDNA），经过抗肿瘤药物诱导，DNA⁺EVs的分泌量和运载的DNA含量均明显增多；
图2.抗肿瘤药物促进EVs和DNA的分泌
首次发现尺寸排阻色谱（SEC）不能有效地将游离DNA从EVs中分离出来，而密度梯度离心可去除绝大部分游离DNA。该实验结果提醒科研人员在利用外泌体包载核酸时，需要特别注意真实核酸包裹量和游离核酸的监测，选取合适的游离核酸去除方法。

图3.EVs中核酸种类鉴定

这项研究为深入了解DNA与EVs的关系提供了直接和确凿的实验证据，为后期外泌体装载核酸提供理论经验和基础，有望促进外泌体核酸药物的研发。NanoFCM可在单颗粒水平对EVs游离的核酸和内部核酸进行定量分析，确定DNA在EVs中分布情况，优化核酸投料量、缓冲液体系、孵育时间等核酸包裹条件，另外可评估不同纯化方法对EVs游离DNA的影响。NanoFCM对EVs核酸药物装载研究具有如下优势：

- 可检测到200 bp 单个游离的DNA超高灵敏度，实现EVs内部核酸、表面核酸、游离核酸的精确定量分析。
- 检测范围覆盖整个外泌体（40—200nm）粒径范围，对整体外泌体核酸装载分布进行分析。
- 在单颗粒水平测定EVs核酸的种类和含量，确定核酸包封率和含量
- 优化核酸装载条件、纯化方法等，获得高质量外泌体核酸药物。

参考文献：

Haisheng Liu etal. Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry. Journal of Extracellular Vesicles, 2022, e12206.
Thomas C. Roberts et al. Advances inoligonucleotide drug delivery. Nature reviews Drug Discovery (2020),19, pages 673–694
Kulkarni, J.A. et al. “The Current Landscape of Nucleic Acid Therapeutics.” Nature Nanotechnology, 2021,16(841):630-643