福流生物
技术介绍
尺寸从几十纳米到数百纳米不等的纳米粒子（NPs）展现出许多新奇的特性，在许多应用中引起了极大关注，包括催化、药物递送、生物医学诊断、癌症治疗以及生物传感与成像等。此外，自然界中还存在着许多天然生物纳米粒子，如病毒、细胞器和分子组装体，由于异质性是纳米粒子的一个显著特征，发展先进的单纳米粒子检测技术，甚至单荧光分子和生物大分子检测技术，对于揭示传统整体平均测量所掩盖的异质性或稀有事件至关重要。
流式细胞术（FCM）是一种成熟的技术，用于快速、多参数、定量分析水悬浮液中的单个细胞和微观粒子。通过光散射测量可以获取有关粒子尺寸、形状和形态的信息；通过荧光标记则可以表征生物细胞的生化性质，如核酸含量、酶活性及表面抗原。然而，传统流式细胞术在检测小于500纳米的粒子或荧光分子数量少于数百个的微弱粒子方面一直面临挑战。显然，发展能够快速、多参数表征单个纳米粒子物理化学特性的先进流式细胞术，对于纳米生物技术和生物科学研究具有重要意义。
我们团队首次将瑞利光散射技术融入鞘流单分子荧光检测技术，通过减小探测区体积至飞升级（femtoliter）以及延长纳米颗粒穿越激光探测区的时间至毫秒（milliseconds）等措施有效地降低背景信号和增强发射光子数，使流式检测技术的检测灵敏度大幅度提升，创建单颗粒水平多参数定量表征新技术－纳米流式检测技术，实现了单个低折射率纳米颗粒的散射检测灵敏度达到前所未有的24 nm（较传统流式细胞仪至少提升5个数量级），实现了纳米颗粒的多参数同时表征，检测速率高达每秒钟上百次。
NanoFCM提供了一个多功能且强大的平台——Flow NanoAnalyzer（纳米流式检测仪），用于在单粒子水平对功能纳米粒子（7-1000纳米）进行多参数分析。光散射用于测量纳米粒子的尺寸及尺寸分布；荧光检测用于分析纳米粒子的化学性质。由此，可表征纳米粒子表面偶联生物分子的尺寸、浓度、化学属性及生物学特征，并在单纳米粒子水平实现这些属性的关联分析。
随着研究的深入，我们意识到许多纳米载体仅能包载极其有限的生化分子。NanoFCM通过一系列策列进一步了NanoAnalyzer的单分子荧光检测能力：提升光收集效率、优化荧光分子爆发信号，并引入空间维度激发，在鞘流中实现了对单荧光分子的稳定分析，推出了全新的单分子检测平台——Single-Molecule NanoAnalyzer（单分子纳米生物分析仪）。基于其单个荧光团、抗体及mRNA的分析能力，该平台可实现多种纳米粒子微弱或难以检测的生化特性定量表征。
凭借卓越的荧光灵敏度，Single-Molecule NanoAnalyzer为在单分子水平解析纳米粒子（7-1000纳米）的独特组成与功能开辟了新途径，其应用范围涵盖细胞外囊泡（EVs）、mRNA脂质纳米粒（LNPs）和病毒载体等。该平台将成为纳米生物载药研究中不可或缺的工具。
1）高分辨的纳米颗粒粒径分布快速表征技术
电子显微镜（透射电镜和扫描电镜）是纳米颗粒粒径和形貌表征的首要方法，但是存在样品制备繁琐、测量速度慢、尤其是粒径分布统计存在一定的主观性并且因为统计个数偏少（100-200 个）而缺乏代表性等不足。动态光散射技术（dynamic light scattering, DLS）虽然能够快速、准确地测定纳米颗粒悬液的平均粒径，但是这种集权平均的检测技术分辨率较低，不适用于混合样或者多分散样品的检测，灰尘或杂质颗粒存在时容易出现较大的偏差。纳米流式检测技术通过对单个纳米颗粒散射光强度的测定实现其颗粒粒径的表征，可以在1 分钟的时间内对几千个纳米颗粒的散射光强度进行逐一测定，借助同样材质的粒径标准球，实现纳米颗粒粒径分布的高分辨表征（对于二氧化硅纳米颗粒，分辨率为~5 nm），仅需2-3 分钟就可获得透射电镜需要数小时才能得到测试结果，而且更具统计代表性。
2）基于单颗粒计数的纳米颗粒浓度测定方法
纳米颗粒浓度的准确测定是纳米科技发展的一个重要保障，而对于形状不规则、粒径不均一的复合或杂化纳米粒子，目前国际上还没有一种切实可行的颗粒浓度准确测定方法。基于单颗粒计数，我们发展了纳米颗粒浓度的无标样绝对定量和荧光纳米微球内标定量两种方法，具有快速（2－3 分钟）、简便（悬液检测）、灵敏（10 微升fM－pM 的颗粒样本）、不受限于颗粒形状的规则性、无需了解颗粒的材质密度等优点，解决了形状不规则、复合、杂化纳米粒子的浓度难以准确测定的问题（J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 12176-12178）。目前已实现聚苯乙烯纳米粒子、二氧化硅纳米粒子、聚吡咯/二氧化硅复合纳米粒子、纳米金、纳米银、病毒、细菌以及阿霉素脂质体、siRNA-脂质纳米粒等颗粒浓度的准确测定。
3）纳米载药系统的多参数定量表征新技术
在纳米颗粒粒径及其分布、颗粒浓度快速表征的基础上，在纳米流式检测平台上建立了纳米载药系统的功能分子（如表面偶联靶向分子探针分子，携载的化学药物、基因药物）的定量表征方法，将为生物医学研究和纳米药物研发提供独特的单颗粒水平多参数定量征技术。
4）生物纳米颗粒分析
纳米流式检测仪可以用于天然生物纳米颗粒（细胞外囊泡、病毒、细菌、亚细胞结构）的定量和定性分析。传统流式细胞仪针对的样本主要是细胞，散射光的检测极限通常是300-500nm，很难对细胞外囊泡、病毒、细菌、亚细胞结构进行精确地定量和定性分析。而纳米流式检测仪突破了传统流式细胞仪的检测极限，散射光可以测到24 nm 纳米低折射率纳米颗粒，完全可以满足这些天然生物纳米颗粒的检测需求。
