外泌体纯不纯,一闻就知

Author: Mika Huang     Date: September 5, 2022

以外泌体为基础的细胞间通讯横跨所有生命领域。多项研究表明,与传统的合成载体相比,外泌体在药物递送方面具有若干优势,为现代药物输送开辟了新领域,使得外泌体近年来备受科研、产业界乃至资本市场的关注。但是以外泌体为基础的治疗的临床转化仍然面临着诸多挑战。其中,如何精准且快速地实现外泌体治疗制剂的质量控制成为外泌体产业化领域目前亟需解决的一项问题。2022年5月10日,国家发展改革委印发《“十四五”生物经济发展规划》(以下简称《规划》)。《规划》明确指出需建设外泌体治疗产品等新型治疗制剂及方案的质量及安全性评价技术平台。
外泌体来源环境复杂,其中往往存在大量脂蛋白、蛋白团聚体及其他非囊泡组分。高纯度外泌体的分离制备成为高质量外泌体制剂研发和生产的先决条件。但是由于外泌体不仅个体极其微小,携载的蛋白、核酸、脂类等“货物分子”含量极低,而且因来源细胞、细胞状态以及分泌途径的不同使得外泌体在尺寸、膜蛋白和内含物等方面存在高度的个体差异性和多样性。这些固有因素提出了在单颗粒水平对外泌体质量评估的这一重要需求。

2018年,国际细胞外囊泡学会(International Society for Extracellular Vesicles, ISEV)集合该领域内多位专家,编写并推出了细胞外囊泡研究指南(Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018, MISEV2018)。关于外泌体样本的表征,该指南明确提出以下要求:

传统表征方案

i. 至少3个外泌体标志蛋白(膜表面蛋白以及内腔蛋白)
ii. 至少一个阴性蛋白

单个外泌体表征

i. 电镜成像
ii.其他非电镜的单颗粒表征平台

此外,目前尚且没有关于工业生产外泌体的统一质量评估标准。因此,探索和确立适用于外泌体相关治疗产品的质控标准,将极大推动这一领域发展。

外泌体产品的多维度质量控制

从外泌体的结构和组成出发,针对粒径、浓度和纯度等物理参数以及蛋白、核酸等生化指标,NanoFCM提出如下(图1)质量控制建议

图1. 单EV水平的质量控制方法

粒径分布及颗粒浓度表征

NanoFCM可在单颗粒水平对外泌体进行无标记的粒径和浓度分析,得到外泌体样品中总颗粒浓度为3.63E12 particles/mL,粒径为 64.9±16.5 nm。同时,外泌体样品的梯度稀释结果表明,NanoFCM对高度异质性的外泌的样品也具有非常好的线性相关(R2 =0.9925)。

图2. 单外泌体水平的粒径及浓度表征(左)稀释性测试(右)

基于膜结构的外泌体纯度检测

1. 颗粒蛋白比测定纯度

通过外泌体颗粒与蛋白浓度的比例来判断外泌体样本纯度,该方法于2013年提出,比值越高,纯度越高。但该方法受限于当时检测设备的灵敏度,仍然是基于群体类型的检测。对于单外泌体颗粒检测的设备灵敏度提出了极高的要求,纳米流式检测技术是目前国际上唯一已知的能对外泌体实现粒径几乎全覆盖的单颗粒多参数定量表征技术,可实现小粒径样品的区分检测,且具有非常好的线性。

图3. NanoFCM散射性能和稀释线性

2. Triton X-100测定纯度

是一种表面活性剂,可裂解外泌体的膜结构。可通过对比裂解前后外泌体样品的颗粒数变化,得到外泌体样本纯度。如图4所示,经Triton X-100处理,该外泌体样品中颗粒数目明显下降,计算可得该外泌体样品纯度为66.0%。

图4. 基于Triton X-100膜处理的外泌体纯度检测

3. 膜染料测定纯度

公司自主开发的膜染料可实现对外泌体样品中含有膜结构的颗粒的标记,从而实现样本纯度分析。如图5所示,经绿色荧光脂膜染料染色,该样本中79.5%的颗粒因具有膜结构而被该脂膜染料标记,且荧光强度与颗粒粒径呈现正相关。该膜染料不与膜结构结合时无本底荧光信号,嵌入脂膜后荧光信号大大增强,因此无需去除游离染料,与传统膜染料相比使用更为便捷。

图5. 膜染料标记外泌体纯度

基于蛋白检测的外泌体质控方法

由于外泌体具有高度异质性,目前常用跨膜蛋白如CD9、CD63和CD81作为外泌体的标志蛋白,用于外泌体的鉴定。NanoFCM单颗粒水平表征结果揭示该样本中并非所有外泌体均有这三种蛋白的表达,表达比例为50%左右(图6)。该检测方法的样品用量仅为传统Western Blot的1%,在不同类型的肿瘤相关疾病早期诊断和疗效监控的蛋白标志物筛查中具有重大潜力。

图6. 常用蛋白标记物检测

基于核酸检测的外泌体质控方法

近年来,基于外泌体核酸的疾病诊断和治疗的相关研究呈现井喷式发展。通过核酸染料标记的方式可以实现外泌体上核酸的定位分析,包括内部、表面和游离状态的核酸,对核酸的丰度和状态进行综合分析。
结合SYTO16核酸染料标记及酶处理策略,利用NanoFCM对外泌体中DNA分子的存在形式及分布特征在单颗粒水平进行了详细分析(图7),外泌体运载的DNA分子主要为dsDNA;外部粘附DNA的外泌体粒径相对较小,而内部包裹DNA的外泌体粒径相对较大;经超速离心和SEC方法制备的外泌体样本中存在着大量与囊泡颗粒不相关的游离DNA分子。

图7. 外泌体核酸测定和分布

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参考文献
1.Tian Y et al. Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nanoflow cytometry[J]. Journal of Extracellular Vesicles, 2020, 9, 1697028
2.Tian Y et al. Protein profiling and sizing of extracellular vesicles from colorectal cancer patients via flow cytometry[J]. ACS Nano, 2018, 12(1): 671-680.
3.Liu H et al. Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry[J]. Journal of Extracellular Vesicles, 2022, 11, e12206
4.Niu Q et al . Quantitative Characterization of Purity, Concentration and Size Distribution of Bacterial Membrane Vesicles at Single-Particle Level. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2021, 49(5): 733-742.