细菌检测

TRULY QUANTITATIVE MEASUREMENT OF TOTAL BACTERIAL TITRE

Author: admin     Date: August 25, 2021

细菌是一种广泛存在于自然界的原核微生物,具有体型微小(0.5~5 μm)、结构简单、繁殖迅速、容易变异及环境适应能力强等特点,对人们的日常生活与生产具有诸多影响。一方面,细菌可以寄生在人的消化道与人形成稳定的共生关系,也可以为人类所利用,构建各种基因工程菌用于食品生产、药品生产及环境净化等。例如,以乳酸菌为代表的益生菌被广泛应用于酸奶和饮料的制作,其相关产品由于兼具美味和保健功能而备受消费者的青睐。另外一方面,细菌会分解食品中的营养物质,导致食品营养流失、风味改变及保质期内变质;一些具有重大危害性的致病菌如志贺氏菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的存在直接威胁到消费者的生命健康;随着抗生素被大量和长期使用,特别是滥用和误用,细菌耐药性问题日趋严重,目前已成为当今人类抗感染治疗中面临的最严峻的挑战之一。因此,发展快速、灵敏、特异的细菌检测分析方法对食品安全、环境检测、疾病机理及诊断治疗和生物恐怖袭击的防范等方面具有重要意义。

随着科学技术的不断发展,目前可用于细菌检测和分析的方法多种多样。第一类是传统的基于平板培养的方法,简称平板培养法。但是,该方法工作量大、实验耗材多、实验周期长以及只能培养自然环境中的一小部分微生物。第二类是基于多细胞测定的细菌分析方法,比如聚合酶链式反应技术(PCR)、酶联免疫反应实验(ELISA)、代谢组学技术和各种生物传感技术等。基于多细胞测定的分析方法通过分析细菌的特定成分来间接反映细菌的存在,这些特定成分有可能只是细菌裂解后释放的分子,无法证实一个完整细菌的真实存在,不能同时对细菌的生理状态进行表征,可获得的信息量非常有限。第三类是单细胞水平的细菌检测方法,比如显微镜观察、流式细胞仪(FCM)分析和微流控芯片技术等。理想的单细胞水平检测应具备高灵敏度和高通量两个条件,然而,目前主流的单细胞水平分析方法绝大多数只能满足上述条件之一。流式细胞术被认为有潜力取代传统的平板培养法成为未来检测细菌的标准方法。

细菌粒径较小,内部结构简单,自身表达的生物分子数目较低(如低丰度的膜蛋白表达),无法标记足够多的荧光探针,因此,它们产生的散射光和荧光信号都较弱.传统流式细胞仪由于检测灵敏度的限制,无法检测粒径小于500 nm或荧光信号小于数百个FITC当量的细菌,然而相当一部分的细菌的粒径小于这个尺寸. 与传统的流式细胞仪相比,纳米流式检测仪的散射检测灵敏度较传统流式细胞仪提高 3-5 个数量级,荧光检测灵敏度较传统流式细胞仪提升几百倍。 纳米流式检测仪已经在细菌检测方面有诸多应用案例。

1. 单个细菌自发荧光的检测与定量

细菌在可见光区的自发荧光会掩盖低拷贝荧光标记分子或者低丰度荧光蛋白所产生的微弱荧光信号,从而影响荧光显微镜成像和流式细胞仪检测。另一方面,自发荧光的检测也能够为细菌的鉴别提供一定的理论依据。细菌的自发荧光信号主要来源于细菌中氧化型的核黄素类物质(NADH、NADPH、FAD等),它们的最大吸收波长位于488 nm附近,发射光谱则与FITC荧光通道的滤光片相匹配。采用几种不同大小且FITC当量已知的荧光纳米颗粒绘制荧光强度和FITC当量的标准工作曲线,继而对单细菌水平的自发荧光进行定量。

表1. 单颗粒水平对细菌自发荧光进行定量

 Anal. Chem. 2012, 84, 1526-1532.

 

2. 单细菌低拷贝蛋白的高通量测定

在细菌中,存在许多低拷贝的重要的蛋白和转录因子,发展高灵敏的检测分析方法对于低拷贝蛋白的检测具有重要意义。b-半乳糖苷酶是一种在原核和真核微生物体系中最成熟、常用的报告分子。传统的检测方法得到的是大量细菌中b-半乳糖苷酶表达及活性的平均效应,掩盖了细菌之间的表达差异。因此,在单个细菌水平考察b-半乳糖苷酶的表达更有利于了解基因表达的随机性、基因调控以及微生物的生理过程。采用b-半乳糖苷酶的亲脂性荧光底物C12FDG对细菌进行染色,结合荧光底物MUG显色和荧光分光光度计确定每个细菌中b-半乳糖苷酶的平均拷贝数,可将纳米流式检测仪检测得到的荧光统计分布直方图转化为b-半乳糖苷酶的拷贝数及其分布。

表1. b-半乳糖苷酶的平均拷贝数伽马分布拟合的各项参数
*: Average number of b-gal molecules per cell is determined by the quantitative MUG fluorometric assay integrated with rapid bacterial enumeration on the HSFCM.
**: and are the two parameters characterizing the gamma distribution. The mean (n) and standard deviation (s ) of the protein number distribution are calculated from and b.

Biosens. Bioelectron. 2013, 48, 49-56.

 

3. 基于b-内酰胺酶活性的耐药菌快速筛查

近年来抗生素滥用导致细菌耐药日趋严重,已对人类健康构成严重的威胁。在多种细菌耐药机制中, b-内酰胺酶是引起80%病原菌耐药的主要原因,它能水解抗生素的核心结构,使抗生素失效。临床样本中存在耐药菌和敏感菌并存的情况,传统的检测手段难以检测少量耐药菌的存在。因此,发展快速、灵敏的单细胞水平b-内酰胺类耐药细菌的检测手段对于临床诊断和制定有效的治疗方案具有重要意义。b-内酰胺酶荧光底物LBRL1被b-内酰胺酶水解后,会释放出荧光残基,共价结合在耐药菌内的蛋白上,从而可利用纳米流式检测仪实现耐药菌的单细胞水平检测。

Chem. Eur. J. 2013, 19, 10903-10910.

4.细菌感染及细菌耐药的临床诊断

有研究指出,单个个体有可能被多重感染,即耐药菌与敏感菌可能同时并存于同一个病人体内。通常情况下,耐药菌并不是优势生长菌,但若没有及时被检出,一旦给药失误,敏感菌的增殖被抑制,原本低比例的耐药菌反而在体内菌群中占据优势,从而延误诊断与治疗,所以少量耐药菌的检测至关重要。通过荧光标记的抗体与核酸染料对细菌进行双染,建立基于纳米流式检测技术的细菌耐药免疫荧光检测平台,实现混合样品中少量耐药菌(低至0.1%)的准确测定。此外,将该方法应用于临床尿液样本的检测,对耐药菌、敏感菌的生长状态进行了动态实时监测,为疾病的诊断和抗生素治疗方案的制订提供科学依据。

动态观测抗生素对样本中耐药菌含量的影响

Biosen. Bioelectron. 2016, 80, 323-330.

 

5. 饮用水、茶饮中细菌总数的检测

饮用水的安全对人类的健康至关重要,而饮用水中细菌的数量是直接反映水质的一个指标,因为细菌的数量在一定程度上反映了饮用水中病原菌数。目前,引用桶装水已相当普遍,而桶装饮用水在启封后至饮用完毕的一段时间内,其水质变化尤其是细菌数量的变化情况引起人们的关注。实际工作中经常以检验细菌菌落总数来间接判断水的卫生学质量,这种方法往往需要数天时间,且不能检测活的不可培养状态(Viable But Non-Culturable, VBNC)的细菌。使用核酸染料PicoGreen对细菌进行染色,非细菌的杂质颗粒由于没有核酸而无法被染色,能够在纳米流式检测仪上同时产生散射和荧光信号的颗粒则为细菌。纳米流式检测技术用于饮用水和茶饮中细菌的快速检测,不仅缩短了检测时间,而且能成功检测出活的非可培养状态的细菌。

 纳米流式检测装置对瓶装和桶装矿泉水中细菌的检测


 Anal. Methods 2015, 7, 3072-3079.

6.致病菌和总菌的绝对定量检测

快速、灵敏、特异的致病菌检测分析对食品安全、环境监测、疾病诊断治疗和生物恐怖袭击的防范等具有重要意义。传统的病原微生物检测方法需要对细菌进行分离、培养及一系列生化反应,操作复杂、检测周期长,且无法适用于难以培养的病原菌,远不能满足实际需求。传统的流式细胞仪在致病菌的高灵敏检测方面仍然存在较大的局限性。使用Alexa Fluor 647-R-PE染料作为致病菌E. coli O157:H7单克隆抗体的荧光探针,使用荧光染料SYTO 9对细菌的核酸进行染色,在纳米流式检测装置上实现双荧光通道同时检测。致病菌在绿色和红色荧光检测通道能同时产生荧光信号,而只在绿色通道产生信号的为非致病菌。

纳米流式检测装置对致病菌和总菌的同时分析

Anal. Chem. 2010, 82, 1109-1116.