病毒/病毒载体

TRULY QUANTITATIVE MEASUREMENT OF TOTAL TITER AND SUBGROUP TITER OF VIRUS

Author: admin     Date: August 25, 2021

病毒是一类由核酸分子(DNA或RNA)与蛋白质构成的非细胞形态的营寄生生活的微小有机体的统称,是自然界中分布最广、基因多样性最强的生命形式,同时它也是许多致死性疾病的罪魁祸首。另一方面,关于病毒作为病原体的广泛研究,使人们对其生物遗传信息有了更详细的了解,病毒具备良好的生物相容性和稳定性,其尺寸微小(20~200 nm)、生长繁殖迅速、容易大规模生产,且基因改造相对容易,可通过化学或基因工程的方法进行修饰,使其发挥特定的功能,如作为医学诊断和治疗的试剂、基因传递的载体和抗菌剂等。

自有历史记载以来,病毒的每一次肆虐都给人类带来了巨大的灾难。当前新冠疫情肆虐,疫情的世界大流行已成为必然趋势,直接影响整个世界的格局和未来走向。一些动物病毒甚至被制成生化武器,对人类的生命安全和社会安定产生重大威胁。病毒作为一种病原体,科学家对其进行了广泛的研究,对它们的生命周期,包括生物、遗传和物理的性质都有了深入的了解,进一步控制宿主细胞内的自组装过程可实现病毒颗粒的修饰,从而发展对人类有利的应用。

病毒颗粒具有许多能够应用于纳米生物学和纳米医学的天然特征,基于病毒纳米颗粒及其材料学性质的相关应用存在着前所未有的机遇。近年,溶瘤病毒领域的科学研究取得了巨大进展,新城疫病毒、单纯疱疹病毒、呼肠孤病毒和溶瘤腺病毒等皆因嗜肿瘤特性而被改造成溶瘤病毒,从而具备特异性识别并裂解肿瘤细胞的功能,但对正常体细胞不具备杀伤作用。慢病毒和腺病毒载体可以高效传递和表达基因,作为miRNA和shRNA的递送载体,可用于细胞的高效转染,在RNA干扰的研究方面具备发展潜力。随着免疫细胞治疗、基因编辑等技术手段在医疗领域的不断发展,细胞治疗产品为一些严重且难以治疗的疾病提供了新的治疗思路与方法,CAR-T细胞疗法已成为肿瘤治疗领域中新的国际研究热点,也不断取得令人鼓舞的进展。作为一种基因导入系统,AAV病毒载体具有安全性好,免疫原性低,能感染分裂细胞和非分裂细胞,能介导基因的长期稳定表达等优点,因此在神经系统的体内和体外研究中,受到越来越多的关注和重视。

1.病毒的单颗粒水平无标记检测

病毒纳米颗粒个体微小(直径主要分布在20-200 nm),结构简单,传统的流式细胞仪无法检测低于200 nm的颗粒,因而并不是检测病毒颗粒的最佳选择。纳米流式检测技术为流式检测病毒颗粒开辟了蹊径。

纳米流式检测技术能够根据散射光强度的差异从混合物中区分四种不同类型的噬菌体。实现不同病毒纳米颗粒的粒径的快速检测。相对于传统的透射电镜表征技术,该方法对病毒纳米颗粒悬液进行直接检测,将分析时间从数小时缩短至几分钟。

病毒产品制备过程中,每个批次病毒的纯度或病毒空壳的比例通常是人们关注的一个问题,利用纳米流式检测装置快速、高通量的优势,可以对病毒产品进行快速高通量表征和实时质量控制。 病毒衣壳因其卓越的生物相容性、均一的结构和容易改造等优点在纳米技术和纳米医药领域有着广泛的应用前景。此外,病毒将基因组传递到宿主细胞进行自我复制的过程对于研究药物释放机理大有裨益。以T7噬菌体为例,将NaClO4作用于噬菌体,诱导其基因组释放,利用纳米流式检测装置在单颗粒水平进行动态监测,同时考察NaClO4作用浓度对噬菌体基因组释放的影响。

2. 颗粒材质对于散射光的影响

根据Mie散射理论,纳米颗粒的散射截面不仅与颗粒粒径有关,还受到颗粒与周围介质的相对折射率的影响。目前,许多测定病毒粒径的方法都选用聚苯乙烯微球作为粒径标准。然而聚苯乙烯微球的折射率(1.59~1.60)高于病毒等生物材料的折射率(1.40~1.47),这无疑会造成较大的粒径检测误差。根据病毒的结构组成,可以推测其折射率为~1.46,与二氧化硅的折射率(1.463)相近。选取粒径相似的T7噬菌体(头部直径60 nm)、二氧化硅纳米颗粒(60 nm)和聚苯乙烯微球(63 nm)来检验折射率对散射光强度的影响。结果表明T7(头部直径约为60 nm)和60 nm二氧化硅纳米颗粒的峰高和峰面积相近,可推测出二者具有相近的折射率。

不同材质相似粒径(60 nm)的纳米颗粒检测结果

   Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 10239-10243.

3. 病毒疫苗

4、药物递送载体

病毒颗粒可以被视为天然的核酸纳米药物,由病毒空壳(药物载体)包裹着核酸(药物)。通过核酸染色,可以快速从混合物中分辨完整病毒、病毒空壳、游离核酸等多种组分,进一步揭示药物包裹效率、包裹量、以及有效药物的比例等参数。

5、CAR-T慢病毒载体

嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)是近年来发展迅速的一种免疫疗法,其中非常关键的环节是给T细胞装备上能够特异性始别肿瘤细胞的分子(CAR)。慢病毒(Lentivirus, LV)是CAR-T中最常用的病毒载体,慢病毒的综合表征对于能否成功构建CAR-T起到至关重要的作用。
慢病毒尺寸在80-120 nm范围内,其散射光可以直接检测,通过核酸染料标记核酸,免疫荧光标记可实现荚膜上蛋白的特异性识别,只有核酸标记和蛋白标记同时产生信号的病毒颗粒才能被认定为一个有效的慢病毒载体。对样本中的慢病毒载体进行核酸和蛋白的双标分析,不仅可以优化病毒生产条件,将病毒产量最大化,也可以通过调控质粒的加入量,筛选出有效表达荚膜蛋白的毒株。

6. 溶瘤病毒

溶瘤腺病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒,可侵染肿瘤细胞,在其中大量增殖并最终摧毁肿瘤细胞。通过特异性修饰使细胞外囊泡靶向肿瘤细胞,将溶瘤腺病毒包装进入细胞外囊泡,制备可以靶向肿瘤部位的溶瘤病毒复合体。

使用荧光染料CFSE和SYTO62核酸染料分别标记囊泡和溶瘤腺病毒的核酸,通过计算核酸阳性的信号与CFSE阳性信号的比值可以快速获得溶瘤病毒的包封率。

7. AAV