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基础应用 – 福流生物

27 nm MS2的无标记检测

Author: Mika Huang     Date: February 15, 2023

病毒是自然界中分布最广、个体数量最多的生命形式,同时它也是许多致死性疾病的罪魁祸首。历史上各种传染性病毒如流感病毒、天花和埃博拉病毒的肆虐给人类带来了巨大的灾难;动物病毒和植物病毒感染造成畜牧业和农业的巨额经济损失。另一方面,病毒具备良好的生物相容性、稳定性、生长繁殖迅速和容易大规模生产等特点,且可以通过化学或基因工程的方法进行修饰,使其发挥特定的功能。病毒颗粒的物理化学性质对其功能有直接影响,因而发展快速、灵敏、通用的病毒颗粒表征方法对病毒技术的开发和推广至关重要。

传统的流式细胞仪无法检测低于200 nm的颗粒,然而,由于病毒纳米颗粒个体微小(直径主要分布在20-200 nm),结构简单。因此,传统的流式细胞仪不能满足病毒颗粒的日常检测需求。目前,尚没有一种技术能在单颗粒水平实现病毒纳米颗粒的无标记、快速、准确检测。而纳米流式检测技术的发展为流式检测病毒颗粒开辟了蹊径。

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图1. 纳米流式检测仪对轻小病毒MS2的无标记检测

本实验中选取的病毒是粒径仅为27 nm的轻小病毒MS2,其结构为正二十面体,遗传物质为单链环状RNA。对MS2病毒检测的信噪比为11,表明纳米流式检测仪在辨别MS2病毒与背景噪声方面具备非常高的灵敏度,这个灵敏度能够满足自然界中绝大多数病毒纳米颗粒的检测需求。

Angew. Chem. Int. Edit., 2016, 55(35), 10239-10243.

粒径分析

Author: Mika Huang     Date: February 15, 2023

一、颗粒材质对于散射光的影响

根据Mie散射理论,纳米颗粒的散射截面不仅与颗粒粒径有关,还受到颗粒与周围介质的相对折射率的影响。目前,许多测定病毒粒径的方法都选用聚苯乙烯微球作为粒径标准。然而聚苯乙烯微球的折射率(1.59~1.60)高于病毒等生物材料的折射率(1.40~1.47),这无疑会造成较大的粒径检测误差。根据病毒的结构组成,可以推测其折射率约为1.46,与二氧化硅的折射率(1.463)相近。选取粒径相似的T7噬菌体(头部直径60 nm)、二氧化硅纳米颗粒(60 nm)和聚苯乙烯微球(63 nm)来检验折射率对散射光强度的影响。

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二、病毒混合物的粒径分辨

病毒作为一种应用广泛的生物纳米颗粒,它的粒径在动态传递、疾病预防、传染病爆发及影响方面扮演了重要的角色。对病毒颗粒实现高分辨率和高通量的粒径分布甚至内部成分表征在病毒学研究、疾病诊断和治疗以及生物纳米技术应用中都非常必要。在此使用二氧化硅纳米颗粒作为病毒粒径测量的标准,将一系列粒径已知(经TEM表征)的二氧化硅纳米颗粒制成混合物,经纳米流式检测仪测量后,绘制散射光强度与颗粒粒径的标准工作曲线,即可将同等采样条件下病毒的散射光强度转换为颗粒粒径。

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纯度测定及质量控制

Author: Mika Huang     Date: March 1, 2023

病毒产品制备过程中,每个批次病毒的纯度或病毒空壳的比例通常是人们关注的一个问题,利用纳米流式检测仪快速、高通量的优势,可以对病毒产品进行快速高通量表征和实时质量控制。 病毒衣壳因其卓越的生物相容性、均一的结构和容易改造等优点在纳米技术和纳米医药领域有着广泛的应用前景。此外,病毒将基因组传递到宿主细胞进行自我复制的过程对于研究药物释放机理大有裨益。以T7噬菌体为例,将NaClO4作用于噬菌体,诱导其基因组释放,利用纳米流式检测仪在单颗粒水平进行动态监测,同时考察NaClO4作用浓度对噬菌体基因组释放的影响。

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图1. 不同批次T7噬菌体的粗提混合物与纯品的对比

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图2. 不同浓度的高氯酸钠对T7噬菌体基因组释放的影响

纳米流式检测技术具备卓越的分辨率,能够区分粗提混合物中不成熟病毒颗粒的散射光信号(~1100 counts)和基因组释放后蛋白空壳的散射光信号(~600 counts)的微小差异,这对于病毒结构学的研究将大有裨益。

Angew. Chem. Int. Edit., 2016, 55(35), 10239-10243