单个细菌自发荧光的检测与定量

细菌在可见光区的自发荧光会掩盖低拷贝荧光标记分子或者低丰度荧光蛋白所产生的微弱荧光信号,从而影响荧光显微镜成像和流式细胞仪检测。另一方面,自发荧光的检测也能够为细菌的鉴别提供一定的理论依据。细菌的自发荧光信号主要来源于细菌中氧化型的核黄素类物质(NADH、NADPH、FAD等),它们的最大吸收波长位于488 nm附近,发射光谱则与FITC荧光通道的滤光片相匹配。采用几种不同大小且FITC当量已知的荧光纳米颗粒绘制荧光强度和FITC当量的标准工作曲线,继而在单细菌水平对细菌自发荧光进行定量分析。

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纳米流式检测仪可以检测到单个细菌的自发荧光信号,这些荧光信号主要来源于细菌中氧化型的核黄素类物质。

Anal. Chem., 2012, 84(3), 1526-1532.

低拷贝蛋白的绝对定量

在细菌中,存在许多低拷贝的重要的蛋白和转录因子,发展高灵敏的检测分析方法对于低拷贝蛋白的检测具有重要意义。β-半乳糖苷酶是一种在原核和真核微生物体系中最成熟、常用的报告分子。传统的检测方法得到的是大量细菌中β-半乳糖苷酶表达及活性的平均效应,掩盖了细菌之间的表达差异。因此,在单个细菌水平考察β-半乳糖苷酶的表达更有利于了解基因表达的随机性、基因调控以及微生物的生理过程。采用β-半乳糖苷酶的亲脂性荧光底物C12FDG对细菌进行染色,结合荧光底物MUG显色和荧光分光光度计确定每个细菌中β-半乳糖苷酶的平均拷贝数,可将纳米流式检测仪检测得到的荧光统计分布直方图转化为β-半乳糖苷酶的拷贝数及其分布。

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利用纳米流式检测仪和亲脂性荧光底物C12FDG,在单细菌水平实现β-半乳糖苷酶的检测。

Biosens. Bioelectron., 2013, 48, 49-55.

细菌双杂交系统蛋白相互作用检测

蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interactions, PPIs)的表征对于理解细胞信号转导通路至关重要。然而,结合强度的定量测量仍然具有挑战性。基于经典的细菌腺苷酸环化酶双杂交(bacterial adenylate cyclase two-hybrid, BACTH)系统,前期研究证实了相对报告蛋白表达(relative reporter protein expression, RRPE)是与两种蛋白之间相互作用结合强度相关的内在特征。

本研究通过CRISPR/Cas9技术将荧光蛋白tdTomato的基因插入染色体中,并使用12个氨基酸的四半胱氨酸(tetracysteine, TC)标记其中一个相互作用的蛋白质,可通过跨膜双砷染料进一步标记。TdTomato和TC-tag的联合使用可以通过纳米流式检测技术在单颗粒水平上对报告蛋白和蛋白相互作用的表达水平进行快速和高通量分析,从而简化了PPI的定量测量。此外,该研究还使用开发的RRPE-tdTomato-TC-BACTH方法,证明了该方法的灵敏度足以区分亲和力为1.4倍的微小差异,并且可以快速筛选出蛋白质相互作用抑制剂。

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图1. 同时检测tdTomato–TC-BACTH蛋白的表达

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图2. tdTomato-BACTH方法用于靶细胞的快速鉴定

结合双荧光标记分析法,纳米流式检测仪可以消除固定和渗透处理,大大加快样品分析速度。同时进行了定量分析蛋白相互作用和报告蛋白的表达。基于nFCM的tdTomato-BACTH方法,消除传统的琼脂电镀步骤,从而提供靶细胞的高通量鉴定,从而验证nFCM的tdTomato-BACTH方法具有高通量PPI研究的潜力。

Talanta, 2021, 233, 122549.