FDA发布终版CAR-T疗法指南，病毒载体质控重要性凸显

Author: Mika Huang     Date: March 7, 2024

2024年1月，美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)发布了针对CAR-T细胞疗法开发的最终行业指南（以下简称“指南”）。

指南就CAR-T疗法涉及的化学制剂成分、生产和控制(chemistry, manufacturing, and control, CMC)以及药理毒理和临床研究设计给出了具体建议。与2022版草案相比，新版指南变化主要集中在以下几点。

01 更加明确了指南的范围。该指南除了用于CAR-T细胞产品外，其中一些信息和建议也可适用于其他转基因淋巴细胞产品，如CAR自然杀伤(NK)细胞或T细胞受体(TCR)修饰的T细胞。

02 增加了对癌症适应症的关注，主要包括血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤的临床研究设计的建议。

03 CAR结构设计需要降低基因重组事件的风险。此外，基于信号结构域对T细胞的激活作用，建议在非临床和临床阶段对信号结构域的功能进行充分阐述。

04 接受过CAR-T治疗的患者，在二次接受CAR-T治疗时，前一次的CAR-T细胞可能对之后CAR-T细胞的制造（例如扩增或转导率）、效力、体内扩增、安全性和有效性产生巨大影响。因此，可通过评估共同的载体或CAR特征序列来评估上次CAR-T细胞的留存情况。

如图1所示，该指南中强调CAR结构的设计和目的基因被递送到T细胞的过程是决定产品安全性和活性的关键。目前上市的CAR-T产品均采用病毒作为载体，其中应用最为广泛的是慢病毒(lentivirus, LV)载体。LV载体作为关键核心原料，其质量会直接影响下游CAR-T细胞的质量和一致性。指南建议在开始临床研究之前，应对载体的安全性和质量充分确定和评估，包含载体的结构表征、纯度、生物活性、转导滴度、安全性、稳定性等方面（如下图1所示）。此外，指南还建议病毒载体生产过程如果有条件发生变化，如培养纯化设备或培养方法改变等，需要评估这些变化对载体和CAR-T细胞的影响。国内在2022年试行的“细胞治疗产品生产质量管理指南”中也明确指出，对于CAR-T疗法，病毒载体是疾病治疗提供药效活性的重要保障；病毒载体的生产、检验和放行等过程应符合《药品生产质量管理规范》及其相关附录的要求。总之，病毒载体对于CAR-T终产品的重要性在国外和国内现行的相关指南中均有明确阐述。

图1. 摘自指南"Consideration for the Development of Chimeric Antigen Receptor(CAR)T Cell Products: Guidance for Industry"

现有生物制品框架下，CAR-T细胞产品作为基因治疗产品家族的重要成员，受到FDA的严格监管。如图2所示，2020年FDA发布"Chemistry, Manufacturing, and Control(CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications(INDs): Guidance for Industry"。该指南指出对于导致载体纯度下降的污染物需进行表征，常见污染物包括基因缺陷病毒颗粒、无感染活性的病毒颗粒、空壳病毒颗粒或者复制缺陷型病毒颗粒等；检测结果则需要明确区分样本颗粒并以一定的比例形式体现，如完整病毒、空壳病毒或总病毒颗粒、有侵染活性的病毒颗粒。此外，该版CMC指南在药品组成成分中，提到应充分对病毒的物理化学或生物特性进行分析，如给药单位、基因型或表型变异、颗粒数量和大小、聚集体、传染性、比活性（病毒颗粒与感染性单位或完整颗粒与空壳颗粒的比例）、生物活性或效力，和/或免疫活性进行分析和表征。

图2. 摘自FDA指南"Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications(INDs): Guidance for Industry"

综上所述，基于两版FDA指南对于基因递送载体相关的建议，在CAR-T疗法开发和制造过程中，病毒载体的全面、有效、深入表征是至关重要的。现有的检测方法多适用于纯化后的样品，且操作繁琐、耗时，不适用于实际生产和条件优化过程。接下来小编将为您带来NanoFCM在LV载体方向的多维表征方案，仅需1min即可快速获得颗粒粒径、浓度，及p24衣壳蛋白和RNA、包膜蛋白等定量信息，助力CAR-T产业客户从研发、工艺开发到生产过程快速、全面提升LV的纯度和产量，加速开发进程。

01 功能性慢病毒组分鉴定

细胞状态和质粒转染过程决定了病毒的产量，而病毒的纯化方法则决定了病毒的得率和病毒的质量，基于NanoFCM获得的功能性慢病毒组分鉴定结果可用于指导和快速优化LV上游生产和下游纯化过程的条件。

NanoFCM不仅可以在单颗粒水平分析LV颗粒粒径及其分布、浓度，同时可对常见的LV颗粒的生化组分（VSV-G识别蛋白、核酸、脂质、p24蛋白等）进行单一组分鉴定和不同组分之间的共定位分析。如图3所示，展示了表面识别蛋白VSV-G与核酸的共定位结果，其中，P1群体是既有VSV-G识别蛋白又带有核酸的完整性LV颗粒，P2是空壳的LV，P3群体是无侵染活性的LV。基于这一数据结果，可以快速得出体系内完整LV颗粒的比例情况，提供符合FDA指南建议的数据结果。

图3. LV组分鉴定分析

此外，得益于NanoFCM自主研发的NanoPC纯化柱与膜通透剂组合方案，NanoFCM还可以实现LV膜内外不同组分的共定位分析，如p24蛋白与VSV-G、p24蛋白与核酸的共定位分析。图4则展示了p24蛋白和VSV-G蛋白的双标记结果：P1群体是带衣壳且同时具有侵染能力的LV颗粒，P2群体是有衣壳但无侵染能力的LV颗粒，以此逻辑类推P3和P4分别为其他杂质和带识别蛋白但不含衣壳的群体。

图4. VSV-G、p24蛋白共定位分析

02 滴度分析

传统方法常通过ELISA试剂盒对p24蛋白进行定量分析进而计算出LV物理滴度，或通过侵染活性测试确定转导滴度。与p24定量方法相比，NanoFCM可直接测定总的LV颗粒浓度，还可以通过对荚膜内p24蛋白的标记，实现p24阳性的病毒颗粒的定量分析（图5左），图5（右）为基于NanoFCM发展的功能性慢病毒定量分析方法与常用的转导滴度、p24 ELISA检测方法的结果对比，LV样品的病毒颗粒(virus particles, VP)：病毒滴度（infectious units, IU)为100以上，这个结果与基于ELISA的p24定量方法基本吻合（每个TU对应100-1000个病毒颗粒）。此外，p24蛋白的ELISA试剂盒检测结果极易受游离p24蛋白的影响，使得定量结果偏高（图5右），相比之下NanoFCM获得的结果与感染滴度更为吻合。

图5. 慢病毒滴度对比分析

03 EVs污染评估

细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是由细胞分泌的一种活性小囊泡，在生产过程中EVs与LV一起从细胞中释放出来，在大小和内容物组分上与病毒具有相似性，常规的检测技术无法有效区分LV和EVs，因此EVs的残留被认为是LV生产和纯化中非常关键的指标。FDA终版指南中多次提到对于关键质量属性(critical quality attributes, CQAs)的全面表征有助于评估CAR-T产品的稳定性、安全性和有效性。因此，EVs的含量将成为CAR-T从业者越来越不能忽视的一个指标。

如下图6所示，NanoFCM可对EVs表面的蛋白标志物如CD9/CD63/CD81等进行单一或共定位分析，从而获悉体系是否含有EVs以及EVs的浓度情况，进而指导病毒生产工艺优化。

图6. 外泌体污染检测

综上，NanoFCM提供的表征方案在一机多能的基础上，为CAR-T产业用户降本增效，高度契合FDA近期发布的一系列安全预警和指南建议中提到的对CAR递送载体充分表征的需求。FDA安全性重审结果及新版指南的发布，势必会引起该领域更多玩家对于病毒表征的重视。自2022年5月NanoFCM面向全球率先发布慢病毒表征方案以来，受到了CAR-T领域从业者的高度关注。国际知名CAR-T企业诺华、BMS、Umoja以及CDMO公司LONZA、ThermoFisher等已将NanoFCM提供的方案加入到他们的质控环节，相信随着相关监管机构的要求提升、检测技术提升及方案的升级，未来NanoFCM在细胞与基因治疗行业的病毒表征工作中将大放异彩。

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参考文献

• Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products Guidance for Industry[S].

• Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) Guidance for Industry[S].

• 细胞治疗产品生产质量管理指南（试行）[S].