福流生物
JEV前沿|多能干细胞外泌体特异性标志物
Author: Mika Huang Date: April 24, 2024
小细胞外囊泡 (small extracellular vesicles, sEVs) 是细胞间通讯的重要介质，通过各种生物工程方法可以发挥它在治疗方面的作用。多能干细胞 (pluripotent stem cells, PSC) 来源的sEVs作为一种潜在的再生医学疗法，在多种与衰老相关的退行性疾病中表现出巨大的临床转化潜力。针对当前人口老龄化严重的现状，PSC-sEVs具有十分广阔的临床应用前景。然而，由于PSC-sEVs特异性表征手段的缺乏，阻碍了PSC-sEVs由基础研究向工业化转化的应用。
上海交通大学医学院附属第六人民医院汪泱/李青教授团队在国际细胞外囊泡学会 (International Society for Extracellular Vesicles, ISEV) 官方权威期刊《Journal of Extracellular Vesicles》发表了题为“Identification of specific markers for human pluripotent stem cell-derived small extracellular vesicles”的研究论文。该研究基于蛋白组学和纳米流式分析技术，首次鉴定了一组PSC-sEVs特异性的蛋白标志物，为PSC-sEVs的标准化鉴定和质量控制提供了新的视角和强有力的手段。
01 PSC-sEV的蛋白质组学分析及验证
胚胎干细胞 (embryonic stem cells, ESCs) 和诱导多能干细胞 (induced pluripotent stem cells, iPSCs) 均属于PSCs。首先，该研究基于蛋白质组学分析分别对iPSC-sEVs和ESC-sEVs的蛋白组成进行了鉴定。如图1所示，作者在鉴定到的5000多种蛋白质中，发现和选择了7种高度富集的多能性相关蛋白，并结合Western Blot进行验证。结果显示（图1g）其中六种蛋白 (PODXL、YB1、IFITM1、LIN28A、OCT4和Dnmt3A) 在不同多能干细胞来源的EVs中均明显富集，具有作为多能干细胞sEVs标志物的潜力。
图1.PSC-sEVs的蛋白质组分析
作者进一步对这些蛋白在 PSC-sEVs中的特异性表达进行了探究。通过对七种非多能干细胞 (293T、HFF1、huMSC、A549、H460、MCF7、MDA-MB-231) 来源的 sEVs进行分析，Western Blot结果发现LIN28A、OCT4、Dnmt3a在7种非PSC-EVs中不表达，YB1和IFITM1在4种非PSC-EVs中可检测到。PODXL在MCF7-sEVs和MDA-MB-231-sEVs中均有检测到，但条带出现在与PSC-sEV 条带不同的位置，PODXL也可用于有效区分PSC-sEVs与非PSC-sEVs。因此，这四种蛋白 (PODXL、OCT4、Dnmt3a、LIN28A) 被认为可用于PSC-sEVs的特异性鉴定和质量控制。
02 单PSC-sEV水平特异性标志物分析
由于EVs的高度异质性，作者采用纳米流式检测技术 (nano-flow cytometry, NanoFCM) 在单囊泡水平对标志物表达的特异性进行了验证。作者以PSC和7种非PSC细胞来源的EVs为研究模型，考察了3种传统标志物 (CD9、CD63和CD81) 、膜蛋白PODXL和表面糖脂SSEA4的表达情况。如图2所示，这些表面标志物在不同细胞系来源sEVs的表达具有极强的异质性。CD9蛋白在的PSC-sEVs中阳性率可达到60%以上，而CD63和CD81的阳性率在PSC-sEVs与非PSC-sEVs之间没有显著差异。对于PSC-sEVs的特异性标志物PODXL和SSEA4在PSC-sEVs中的阳性率分别为50%和70%以上，而在非PSC-sEVs中阳性率仅在1%到18%之间，远低于PSC-sEVs的表达比例。作者进一步利用荧光共聚焦显微镜对PODXL和SSEA4在sEVs上的表达情况进行了观测，其结果显示大多数PSC-sEVs呈现PODXL或SSEA4呈阳性，该结果与NanoFCM检测结果相吻合。综上，单囊泡水平的检测分析进一步印证了PODXL和SSEA4可作为PSC-sEVs特异性标志物。
图2. 不同细胞来源sEVs的多种表面标志物的NanoFCM检测分析
03 密度梯度离心（DGUC）纯化后的PSC-sEVs标志物验证
由于基于超速离心的纯化所得的EVs样本中可能存在非囊泡组分的污染，作者进一步对样品进行密度梯度离心纯化。如图3所示，PODXL、OCT4、Dnmt3a和LIN28A蛋白同样在经由DGUC所得EVs样本中被大量富集，该结果也证明了这些标志蛋白并非来自污染物。此外，NanoFCM分析结果也进一步表明DGUC纯化所得sEVs的CD9、CD63、CD81、PODXL和SSEA4的阳性率均与UC所得EVs相似（图3e-j），进一步排除了所鉴定的标志物来自污染物的可能性，以及不同纯化方法导致的标志物差异的问题。
图3.DGUC纯化后sEVs样品分析
综上所述，该研究首次鉴定了一组 PSC-sEV 的特异性标志物，含PODXL、OCT4、Dnmt3a、 LIN28A、和SSEA4。这些标志物可用于PSC-sEVs的鉴定和质量控制，对于PSC-sEVs的临床应用极具价值。
NanoFCM展望
基于干细胞EVs疗法在疾病治疗领域的研究与应用，NanoFCM凭借其卓越的散射和荧光检测性能，在单颗粒外泌体水平实现了不同丰度的蛋白标志物分析，助力干细胞EVs特异性标志物表征，为干细胞EVs疗法带来新的见解和策略，将大大缩短分析时间，极大加快了干细胞EVs疗法的基础研究和临床转化进程。
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图4.sEVs的免疫荧光染色
