NanoFCM vs 传统流式 | 100% or 1 ‰ 外泌体?

Author: Mika Huang     Date: November 14, 2022

细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)不仅粒径极其微小、携载的蛋白、核酸、脂类等“货物分子”含量极低,而且其个体间存在着高度的异质性和多样性,因此如何对其进行准确的表征分析是一个亟需解决的难题。近年来许多课题组尝试基于流式检测技术开发EVs的分析检测方法,也取得了丰硕的成果,推动着该领域的进步。

流式细胞术通过散射和多色荧光信号对悬液中的颗粒进行检测,散射光可以揭示颗粒的粒径以及材质的疏密程度,荧光标记可以实现基因表达、特异性蛋白表达等生化性状的测定。那么咱们实验室现有的流式细胞仪能不能用来测EVs呢?早在2018年,荷兰阿姆斯特丹大学的研究团队就为大家做了评估。他们在全球范围内征集了46台流式细胞仪进行同步测试,测试结果令所有人大为意外。46台参与的流式细胞仪中仅有22台可以测量600-1200 nm范围内的EVs,只有少数高灵敏度仪器能够检测直径为300-600 nm的EVs。我们知道,EVs的粒径分布为40-1000 nm,其中丰度最高的外泌体位于40-150 nm的范围内,这样的灵敏度检测外泌体简直是天方夜谭。

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图1. 多款流式细胞仪对于EVs的检测灵敏度比较

科学家们从未停止在传统流式上的尝试。近日,苏黎世大学的Chahwan教授团队在BioRxiv预印版发表题为“Assessing extracellular vesicles in human biofluids using flow-based analyzers”的文章,文章综合对比了NanoFCM(纳米流式)和一款流式细胞仪在EVs的粒径、浓度、蛋白表达等方面的表征能力。作者指出之所以选择这两款设备是因为它们在各自的领域领先,已渐渐成为金标准(附评价)。

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T细胞和B细胞来源EVs的综合表征

作者以T细胞和B细胞分泌的EVs为研究模型,NanoFCM以68-155 nm的二氧化硅纳米颗粒(silica nanoparticles, SiNPs)作为粒径标准品,发现这两类免疫细胞来源的EVs主要分布在68 nm以下;而该传统流式细胞仪则以180-1300 nm的SiNPs作为标准品,虽然也发现在180 nm以下可能存在着大量的EVs,但这部分不能从背景中区分,无法实现其粒径分布的表征。且作者发现NanoFCM所得EV粒径分布结果与电镜统计结果一致(图1D),但NanoFCM的通量更高,分析速率可达每分钟上万个颗粒,所得数据更具有统计代表性。基于NanoFCM平台,作者团队还发现B细胞来源的EVs浓度略高于T细胞来源的EVs(图1E)。

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图2. Jurkat和Ramos细胞来源EVs的粒径及浓度表征

随后,作者分别采用这两款流式平台分别对经Cell Trace Far Red荧光染料标记的EVs进行分析。NanoFCM以其优异的荧光检测性能,使得染料标记的EVs与未标记的颗粒完全区分,且阳性颗粒比例为98.3%,远高于传统流式所得的47.6%。在蛋白表达表征方面,NanoFCM可以实现表达CD9这一重要蛋白在单个EVs水平的表征,而该传统流式细胞术则无法满足CD9阳性EVs的分析。基于此,作者利用NanoFCM对T细胞和B细胞分泌EVs表面诸多蛋白的表达情况进行了综合分析,发现CD3在Jurkat细胞EVs中高表达,而在Ramos细胞EVs中低表达;CD19和CD20则在Ramos细胞EVs中高表达,在Jurkat细胞EVs中则低表达。而该传统流式细胞仪则在对这两种细胞EVs在关键蛋白表达情况的分析时明显不足,如部分表达含量低的蛋白无法分析,且即使检测到了部分表达该蛋白的EVs,其检测比例也远低于NanoFCM的表征结果。

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图3. Jurkat和Ramos细胞来源EVs的蛋白分析

血清、尿液、唾液来源EVs综合表征

在对体液来源EVs的蛋白表达进行分析时,作者团队发现虽然这两款流式平台所得的蛋白标志物的表达趋势是一致的,但是NanoFCM所得蛋白阳性EVs的比例明显高于该传统流式所得结果;且NanoFCM可实现EVs中低丰度蛋白的分析(图4)。

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图4.血清、尿液和唾液来源EVs的蛋白分析

如图5所示,作者采用主成分分析法和降维处理的方法对基于NanoFCM得到的EVs蛋白标志物的分析结果进行分析,发现同一体液来源的EVs在蛋白表达中更具有相关性,可用于反映其体液来源,且该结果不受志愿者供体的影响。其中,CD3(T细胞特异性),CD45(白细胞)和CD147(质膜蛋白)在区分血清和其他体液来源EVs的提供了主要权重。尿液和唾液来源EVs的特征没有血清EVs那么明显,其中CD9和LAMP1是尿液衍生EVs的重要特征蛋白。

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图5. NanoFCM所得EV蛋白表征结果的主成分分析和相关性分析

最后作者总结了NanoFCM在EVs分析中的优势

i)更适用于小EVs的分析(40-200 nm),其粒径表征准确度可媲美电镜;

ii)实现EVs的浓度表征;

iii)实现不同EVs亚群的鉴定;

iv)实现EVs表面蛋白共定位分析(表1)。

而传统流式细胞仪则更适用于细胞等大颗粒的表征,虽然具有更多的检测通道、操作相对简便等优势,但其在分析EVs时受到灵敏度不足等因素的制约,而且经常会出现由于EVs浓度过高使得多个囊泡同时出现在检测区,即所谓的“swarming effect”。

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表1. NanoFCM与Cytek Aurora表征EVs对比

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总结

流式细胞术作为一种对悬液中颗粒进行快速、多参数定量分析的先进技术,近年来在EVs的分析中被广泛利用,以揭示EVs个体间的差异性和多样性,极大的推动了该领域的发展。但是由于灵敏度的限制,传统的流式细胞仪难以检测粒径小于300~500 nm的EVs或者荧光亮度小于几百个荧光素分子的信号。此外,鞘液中大量存在的小尺寸颗粒(~200 nm)也会引入背景干扰。当采用传统流式细胞仪对EVs进行定量分析时,占绝大部分的小粒径EVs的散射光光信号或者低丰度分子的荧光信号将会被掩盖于背景信号中。

纳米流式检测技术的面市真正将流式细胞术带入到纳米颗粒表征的世界,在EVs的分析中,展现了其得天独厚的优势,从粒径、浓度等物理参数到蛋白、核酸等生化指标,帮助研究者们揭开EVs的面纱,全方位地破译这些信使所携载的信息。

参考文献

1.Krzyzaniak O, Yim K, Peacock B, et al. Assessing extracellular vesicles in human biofluids using flow-based analyzers[J]. bioRxiv, 2022.

2.van der Pol E, Sturk A, van Leeuwen T, Nieuwland R, Coumans F, for the ISTH-SSC-VB Working group. Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation[J]. J Thromb Haemost, 2018; 16: 1236-45.