阿斯利康入局,外泌体载药竞争白热化

Author: Mika Huang     Date: November 16, 2021

近期全球制药公司阿斯利康(AstraZeneca)在国际杂志Journal of Extracellular Vesicle上发表其在细胞外囊泡(EVs)载药研究的新进展。往期小编介绍过Codiak公司开发的全球首个进入临床I期的工程化外泌体候选药物exoIL-12

近年来国际制药巨头(old money)纷纷投注外泌体载药,未来无限可期。全球Top20的制药公司中,超过70%已经组建了外泌体的研发团队,或者与新兴的外泌体公司建立了战略合作关系,基于新兴公司的载药平台开发创新的外泌体靶向疗法。小编怎么会知道这么多呢?因为这些公司有一个共同点:都拥有NanoFCM这一外泌体表征利器(文末干货介绍外泌体新兴公司在EVs领域载药项目新进展)

该研究目的是筛选出EVs特异性载药骨架蛋白,对比多种EVs表征技术,如WB、NTA、NanoFCM (Nano-Flow Cytometry)、ExoView、SMLM (Single-Molecule Localization Microscopy)等,客观展现不同技术在该工作中的优缺点(更多技术对比,可参考美国约翰霍普金斯大学Kenneth Witwer教授团队发表在JEV上的“外泌体研究四大平台对比文章”),本文将主要介绍阿斯利康的外泌体载药研发流程,为广大EVer们提供参考。

研究思路

利用EVs高表达的骨架蛋白(或多肽)与目标蛋白构建融合质粒,实现目标蛋白药物高效、特异性地载入EVs。而骨架蛋白的筛选通常需要满足以下几个条件:

(ⅰ) 在Vesiclepedia,、ExoCarta 、EVpedia等EVs数据库高表达;
(ⅱ) 定位在EVs膜上;
(ⅲ) 骨架蛋白的分子量<50kDa,以实现高效过表达或改造;
(ⅳ) 毒性低,过表达对EVs生物发生和分泌的影响极小;
(ⅴ) 对与其他蛋白质融合的稳定性和耐受性等。

本研究选用Expi293F悬浮细胞作为表达系统,根据以上条件筛选出两类骨架蛋白,一类是EVs表面蛋白(如CD47、APMAP、CD63、CD81),可实现蛋白药物在EVs表面的装载;另一类是EVs腔内蛋白(SDCBP、TSPAN14等),可将蛋白药物装载在EVs内部。通过将GFP荧光蛋白的基因与这些骨架蛋白基因融合,构建融合质粒,瞬转进入Expi293F悬浮细胞,收集、检测EVs中GFP的荧光强度和比例,可对这些骨架蛋白装载效率进行评价,实现药物蛋白的过表达(图1)。

图1.两类骨架蛋白融合示意图

质量控制(粒径、浓度、纯度表征)

瞬转后的细胞通过一段时间培养,收集细胞上清,通过超速离心对EVs进行纯化,可得到纯度很高的EVs。阿斯利康团队对超速离心纯化后的EVs进行了粒径、浓度、蛋白等多维度的表征。发现过表达骨架蛋白对EVs的形态、粒径没有明显影响,但是共转骨架蛋白可以显著提高EVs的产量(图2),这和已经公开发表的文献相一致。其中在测定浓度和粒径时,应用了NanoFCM (Nanoflow Cytometry)和NTA两种方法,作者指出NTA 测定的浓度比NanoFCM低一个数量级,并且存在EVs粒径结果偏大等问题,表明NanoFCM灵敏度更高,相较NTA可以检测到尺寸更小的囊泡。(图2 原文评论)。

图2. NTA(左)比NanoFCM(右)测定EVs浓度低一个数量级

由于NanoFCM可以检测悬浮液中任何类型的小颗粒,包括分泌的蛋白质和颗粒聚集物,该研究进一步评估了EVs的纯度,用CellTrace Far Red染料标记样品,NanoFCM结果显示几种骨架蛋白来源EVs纯度均高于85%(图3),说明目前的分离纯化方法可以获得高纯度的EVs。

图3.不同骨架蛋白EVs纯度鉴定

骨架蛋白的筛选——特异性检测

理想的EVs载药的骨架蛋白需要这个蛋白在EVs中高表达,同时最好在所有EVs的亚群中都高表达。该研究用NanoFCM检测了GFP表达的阳性率和强度,比例的高低可以显示骨架蛋白在EVs亚群表达的分布情况,荧光强度则可以反映蛋白表达强度。文章发现CD47、SDCBP、APMAP表达比例和强度都很低,而TSPAN14、CD63、CD63TM、CD81TM的表达比例高,在50%左右。其中TSPAN14和CD63这两个骨架蛋白的表达强度明显高于另外两个,这与作者后续用SMLM方法测定单个EVs的GFP拷贝数的结果相印证。这些结果说明EVs具有高度异质性,尽管EVs纯度很高,但是也只有不到50%的EVs表达骨架蛋白(Codiak BioSciences公司用NanoFCM筛选出了表达比例高于95%的两个骨架蛋白);另外,骨架蛋白在EVs中的表达比例并不能揭示其表达量的高低,应用NanoFCM对其表达强度进行定量分析,该研究团队确定了TSPAN14和CD63这两个候选骨架蛋白。

图4.不同骨架蛋白表达比例和表达量分析

除了NanoFCM,该研究也通过ExoView和SMLM对EVs进行了分析。两种技术分析结果与NanoFCM互相印证,TSPAN14和CD63均有较高的表达量。ExoView通过CD9/63/81抗体捕获EVs亚群,获得相关亚群的信息。另外,由于表达GFP的EVs在ExoView平台直接荧光检测信噪比低,作者进一步通过CF555-GFP抗体标记来提高GFP荧光检测的信噪比,腔内荧光蛋白的标记过程涉及膜透化,相比于直接检测操作相对繁琐(图5 左)。

图5.ExoView(左)和SMLM(右)分析EVs

SMLM是一种显微镜成像技术,可以对荧光信号进行统计和计算。作者利用SMLM对EVs上的GFP表达量进行了分析,结果与NanoFCM结果相吻合,进一步验证了NanoFCM具有超高的准确性和荧光分辨率。然而,SMLM无法获得颗粒的粒径、浓度等信息,且需要经过有效的膜标记才可以对EVs进行GFP阳性率分析(图5 右)。

总的来说,该研究通过几种不同的技术筛选出表达比例和表达强度高的TSPAN14和CD63两个骨架蛋白,具有非常大的载药潜力,后期可进一步验证其融合表达目标蛋白的能力和稳定性。

外泌体载药——一切都是套路

EVs的研究流程通常包括从细胞上清、体液、牛奶、组织等样品中分离、纯化EVs,纯化的方法包括超速离心、密度梯度离心、PEG沉淀、亲和层析等;纯化后需要对EVs进行鉴定和纯度的分析,包括其形态、产量、粒径、标志蛋白等指标;鉴定后的EVs可应用于疾病发病机制的研究、疾病诊断、治疗制剂、药物装载等。

目前大部分EVs表征技术主要是对纯化后的EVs进行物理生化性质的鉴定,下表列举出五种表征技术的性能对比,其中,NanoFCM满足粒径、浓度和生化性质的同时表征,可用于分离、鉴定、质控表征的全流程检测,具有非常明显的优势:NanoFCM可在单颗粒水平对EVs进行综合表征,得到EVs颗粒的粒径、浓度、纯度、药物装载比例和载药量,快速优化条件,筛选出优良的载药平台,是EVs载药研究的强有力工具,致力于加速EVs载药的研发进程!

表1: EVs研究流程和表征参数

说明:“-”表示不能测定;“+”表示可以测定,+++>++>+;“$”表示价格, $$$>$$>$

干货分享:外泌体新兴创业公司

据不完全统计,近些年涌现出来的外泌体领域相关的新兴创业公司有近100家。位于美国马萨诸塞州Cambridge的Codiak BioSciences是首家把工程化外泌体疗法推向人体临床试验的单位,这家公司目前有两款产品正在进行临床试验:exoSTING在外泌体的腔内装载了STING(一类干扰素IFN的刺激基因)激动剂,于2020年10月进入I/II期临床试验,用于治疗晚期实体瘤;exoIL-12则是将外泌体进行工程化修饰,使其在表面展示IL-12,用于治疗早期皮肤T细胞淋巴瘤,于2020年9月进入临床I期,从目前已公布的数据来看exoIL-12表现良好。

其它科技公司,如Evox、Capricor、Carmine、MDimune等采用各自独特的技术手段,在不同来源的外泌体上尝试,采用多样化的修饰策略,载入不同的药物。下面的表格列举了几例有代表性的工程化外泌体项目,供后来者参考。

参考文献:

[1]. Silva, Andreia M., et al. “Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single‐vesicle and single‐molecule resolution.” Journal of Extracellular Vesicles 10.10 (2021): e12130.

[2]. Dooley, Kevin, et al. “A versatile platform for generating engineered extracellular vesicles with defined therapeutic properties.” Molecular Therapy 29.5 (2021): 1729-1743.

[3]. Arab, Tanina, et al. “Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single‐particle analysis platforms.” Journal of extracellular vesicles 10.6 (2021): e12079.