病毒载体疫苗 – 福流生物

病毒疫苗的质量控制

Author: Mika Huang Date: February 15, 2023

空斑计数法是用于病毒定量的经典方法，但它需要1-2周（哺乳动物病毒）或1-2天（噬菌体）才能确定感染滴度。虽然酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和定量聚合酶链式反应（real-time quantitative PCR, qPCR）可以分别测定病毒的蛋白浓度和核酸拷贝数，但这些“批量”分析方法的说服力很低，它们无法区分所检测的蛋白或核酸是来源于完整的病毒，还是以游离状态存在的。

图1. 两种灭活疫苗生产过程监测

该研究报道了一种高通量的单个病毒颗粒定量分析方法，以T7噬菌体为模型，通过核酸染料SYTO 82对病毒（或载体）基因组进行染色，用纳米流式检测仪同时检测单个病毒颗粒的侧向散射和荧光信号，可以从混合物中区分出完整病毒、空白衣壳和游离基因组。进一步将此方法用于测定病毒相关产品的物理效价和纯度，以及噬菌体混合物治疗制剂和兽用疫苗产品的快速评价。

Angew. Chem. Int. Ed., 2021, 60, 9351-9356.

药物递送载体

Author: Mika Huang Date: February 15, 2023

病毒颗粒可以被视为天然的核酸纳米药物，由病毒空壳（药物载体）包裹着核酸（药物）。通过核酸染色，可以快速从混合物中分辨完整病毒、病毒空壳、游离核酸等多种组分，进一步揭示药物包裹效率、包裹量、以及有效药物的比例等参数。以T7噬菌体为模型，通过核酸染料SYTO 82对病毒（或载体）基因组进行染色，用纳米流式检测仪同时检测单个病毒颗粒的侧向散射和荧光信号，可以从混合物中区分出完整病毒、空白衣壳和游离基因组。

图1. T7病毒不同组分和构造的鉴定

Angew. Chem. Int. Ed., 2021, 60, 9351-9356.

慢病毒空壳率和完整性分析

Author: Mika Huang Date: March 5, 2023

慢病毒载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒，80-120 nm）为基础发展起来的基因治疗载体，主要由荚膜、蛋白壳以及内部包裹的RNA构成。慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主细胞的染色体上，从而实现外源基因的稳定表达。目前慢病毒滴度检测的主要方法包括：

1）基于病毒侵染活性的转导滴度法（transducing units, TU）；

2）基于实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）的基因组的拷贝数测定；

3）基于酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）的病毒p24蛋白浓度分析。

以上三种常用方法均无法实现慢病毒样本纯度的分析，且检测过程耗时费力。

慢病毒载体能否将基因传递到宿主细胞有两个关键因素：

1）病毒外膜VSV-G蛋白的表达，决定了与宿主细胞表面的受体的特异性结合——“识别”；

2）病毒成功装载了目的基因——“递送”。

在本研究中基于病毒的结构成分创新性地提出了“功能性慢病毒”的概念，即同时具有VSV-G和核酸的颗粒才被认为是一个功能性慢病毒颗粒。结合纳米流式检测技术表征分析，开发了一种简单的用于慢病毒快速表征的方法，可以在慢病毒的生产过程中的每一个环节对病毒浓度进行精确计数，优化、监控病毒的生产过程，从而获得最高的慢病毒回收率。该方法操作简单、检测速度快、准确性高、适用性广，适用于不同种类的病毒样颗粒和病毒载体的分析。

图1. 纳米流式检测仪对慢病毒颗粒不同组分的分析

利用纳米流式检测仪，不仅可以获得完整慢病毒颗粒浓度为1.02 ×10⁸ particles/mL，还可同时获得不同组分的粒径分布与亚群的颗粒浓度。

溶瘤病毒的包封率检测

Author: Mika Huang Date: March 5, 2023

溶瘤腺病毒（oncolytic viruses, OA）是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，利用靶细胞中抑癌基因的失活或缺陷，从而选择性地感染肿瘤细胞，在其细胞质大量复制并最终摧毁肿瘤细胞。同时它还能激发免疫反应，吸引更多免疫细胞来继续杀死剩余的癌细胞。所以，溶瘤腺病毒在肿瘤的治疗中具有广泛的应用前景。但是，由于人体本身的先天性免疫和抗病毒免疫的存在，溶瘤腺病毒的应用受到了限制。研究发现，EVs可作为突破该限制的一种有效工具，其具有免疫豁免和可穿越血脑屏障的能力，还能通过特异性标记靶向肿瘤细胞，继而成为药物治疗的最佳载体之一。

研究表明外泌体包裹的溶瘤病毒具有抗病毒免疫特性，同时通过在外泌体表面标记肿瘤特异性标志物可以提高肿瘤细胞的靶向性，为改善溶瘤病毒治疗肿瘤提供了新的研究策略和平台。将溶瘤腺病毒转载进外泌体是实验中的关键一步，溶瘤腺病毒的包封率和包封效果会直接影响后期的治疗效果。研究者分别使用荧光染料CFSE和核酸染料SYTO 62标记外泌体（BCMNs）和溶瘤腺病毒（OA），利用纳米流式检测仪，可以对单个外泌体和同一外泌体是否含有OA进行同时检测。

图1.溶瘤腺病毒包封率的测定

基于荧光标记方法，利用纳米流式检测仪，得到溶瘤腺病毒的包封率为59.9%，纳米流式检测仪有望在溶瘤病毒治疗肿瘤疾病中发挥重要作用。

Nano Lett., 2019, 19(5), 2993-3001.