近年来,细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)的研究持续升温,成果显著,大量证据表明EVs在多种疾病的诊断、治疗、以及预后监测方面有重要的临床价值。同时该领域也面临诸多挑战,分离纯化方法的选择是其中尤为重要的一个。如何从复杂的临床样本中获得高纯度的EVs呢?
2019年小编曾推送过一篇EVs分离纯化相关的文章《做外泌体,我的分离纯化方法靠谱吗?如何质控?》,厦门大学颜晓梅教授团队综合比较了5种商品化EVs纯化试剂盒和超离的效果,发现与超离相比,几种试剂盒提取的EVs的纯度仍有差距,我们也在持续关注EVs分离纯化方法的新进展。
近日,暨南大学的王通教授和崔毅峙博士团队在国际顶尖细胞外囊泡杂志JEV(IF=25.84)上发表题为 “Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications”的文章,通过优化纯化柱颗粒孔径、填充体积、洗脱体积等改进SEC,发展了二分式SEC法(dichotomic SEC)。利用NanoFCM对分离纯化的EVs进行粒径、浓度、纯度、生化性质等进行评估,发现二分式SEC法只需1次大体积洗脱(总耗时约22分钟)即可将血清/血浆等复杂体液分成两个组分,快速分离获得高纯度EVs,有望加速EVs的临床中研究和成果转化。
图1.二分式SEC法技术开发流程图
通过对比CL-2B、CL-4B、CL-6B三种纯化柱,发现纯化柱的孔径会影响血清来源EVs的分离纯化效果。CL-4B和CL-6B对EVs纯化效果优于于CL-2B,对牛血清样品(FBS)处理后可看到有两个明显的颗粒峰(蓝色)和蛋白峰(红色),并且峰形较为对称,而对于人血清样品(HS),三种纯化柱均有较明显的后拖峰出现(图2)。随后作者考察了树脂填充量对EVs分离的影响,结果发现随着填充树脂体积的增大(20 mL),CL-6B对EVs分离纯化的效果得到显著改善,而洗脱液体积对EVs分离纯化效果影响较小。
图2.不同优化条件对EVs分离纯化影响
对二分式SEC纯化后获得的EVs有必要进行纯化效果的综合评估,选取SW620细胞上清作为研究模型,分别通过物理性质和生化性质几方面评估二分式SEC法获得的EVs样品的粒径分布、颗粒浓度、纯度等信息。
传统的WB通过检测EVs标志蛋白Integrin β3和杂质蛋白(如ApoA1)来反映EVs的纯度,WB结果显示EVs主要存在于Eluate 1组分中,而污染物在Eluate 2组分。通过NanoFCM(纳米流式)在单颗粒水平对纯化获得的EVs的颗粒浓度、粒径、纯度等进行无标记直接分析,发现洗脱的两个组分中,颗粒大小基本一致,说明EVs和杂质颗粒大小差不多,SEC无法分离大小差不多的杂质颗粒。然后用Triton X-100破膜剂处理评估EVs的纯度,EVs因具有膜结构可被破膜而杂质蛋白颗粒不受影响,对比Triton X-100处理前后EVs颗粒数的变化可计算EVs的纯度。NanoFCM结果显示,二分式SEC法获得的EVs纯度高达96.9%(图3),证明该分离方法可获得高纯度的EVs。
图3.WB和NanoFCM测定EVs纯度
用CFDA-SE 标记SW620细胞(标记细胞膜内的蛋白),经二分式SEC法纯化EVs,利用NanoFCM对EVs的生化性质进行检测,测得阳性颗粒的比例和纯度; NanoFCM显示二分式SEC法提取的EVs颗粒中荧光阳性的比例高达95.5%,其中92.4%的颗粒可以被Triton X-100裂解,进一步说明二分式SEC法可以获得高纯度的EVs。另外值得指出的是,NanoFCM可实时观察各通道的原始数据和背景水平,组分Eluate 2(蛋白峰)的荧光背景水平明显高于Eluate 1(颗粒峰),再次验证蛋白峰比颗粒峰具有更多的蛋白颗粒(图4)。
图4.NanoFCM测定EVs比例和纯度
综上,王教授和崔博士团队优化了SEC方法,开发出二分式SEC法(dichotomic SEC),经过NanoFCM的多维度分析验证,此方法不仅可获得与超速离心法相近纯度的EVs,而且EVs的得率也显著提高。
王通教授和崔毅峙博士团队研发的二分式SEC方法只需两步洗脱即可快速获得高纯度的EVs,已经在牛血清、人血清以及细胞上清等样品中得到验证。这种方法简单、实用,在临床试验和基础研究中具有诱人的潜力,同时小编也期待王教授团队能够尽快把产品推向市场,使更多的科研和临床工作者获益。
NanoFCM是一款单颗粒纳米颗粒分析仪器,可对7-1000nm的纳米颗粒粒径、浓度、纯度和生化性质等进行表征,是研究EVs纯化方法、生化性质的重要技术手段,可应用在EVs生产、纯化、载药等各个方向,加快EVs在临床上的应用和转化。