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细胞外囊泡——下一代药物递送平台 – 福流生物

细胞外囊泡——下一代药物递送平台

细胞外囊泡——下一代药物递送平台

Author: Mika Huang     Date: September 2, 2021

细胞外囊泡为基础的细胞间通讯在所有生命中都是保守的。有证据表明细胞外囊泡参与主要的生理病理过程，包括细胞稳态、感染传播、癌症发展和心血管疾病等。越来越多的研究发现，细胞外囊泡相比于传统人工合成的载体有诸多优势，为现代药物递送开辟了新的领域。尽管研究持续进行，但是细胞外囊泡相关疗法的临床转化仍然面临诸多挑战。

近日，来自苏黎世联邦理工学院的Inge Herrmann和德国萨尔大学的Gregor Fuhrmann，以及来自英国牛津大学的Matthew Wood(同时也是EVOX¹创始人)，在Nature Nanotechnology杂志(影响因子39.213)上发表了一篇综述文章，讨论了细胞外囊泡的特殊性，以及充分发挥它们药物载体的潜能所需的严格的设计和必要的研发环节，包括载药方法，深入表征和大规模生产。文章同时展望了细胞外囊泡的和其它成熟的脂质体方法，为指导囊泡药物载体的发展提供方向。

图1. EVs的作用方式和功能

文章将细胞外囊泡的前景与成熟的脂质体的前景进行了比较，希望能够对开发基于囊泡的药物递送系统提供指导。本文将对文章中 EVs 生产过程和质量控制中遇到的问题进行阐述，同时穿插讨论Codiak BioSciences、中山大学附属第三医院等用户在 EVs 相关药物的研发、生产等过程中使用 NanoFCM 去解决问题的思路和方法。NanoFCM 可以对EVs的产量、浓度、大小、载药量、载药效率等参数进行综合表征，从而有望优化 EVs 生产条件，提高生产效率并加速 EVs药物研发的进程。

一、EVs载药平台分类和表征标准
1.基于EVs的载药平台

根据EVs的成分来源，可将EVs递送平台分成3种类型：(如图2)

(1)Natural EVs：包括细胞或基因工程细胞直接提取的EVs

(2)Hybrid EVs：后天修饰了药物或配体的EVs；

(3)EV-inspiredliposomes：类EVs样的脂质体；

图2. EVs的种类

目前脂质体递送在体内和体外的有效性和生物相容性已经得到了广泛的评价，但对于更加复杂的 EVs，仍然缺乏有效的评价方法。对来自不同细胞系的 EVs 及其生物分布模式的比较评价表明，虽然 EVs 主要在肝脏、肺、脾脏和胃肠道中积累，但囊泡的来源和给药途径会显著影响其生物分布。例如，树突状细胞来源的 EVs 优先被脾脏吸收，而黑素瘤细胞来源的 EVs 在肝脏中积聚明显。相较于脂质体，EVs 具备靶向特定细胞的功能，并且具有更大的载药能力。目前已经有多项间充质干细胞(MSCs)来源的 EVs 应用进入临床试验(如表1)，利用 EVs 载药，未来可期。

表1.进行中的EVs临床试验

表1.进行中的EVs临床试验

2.对EVs的表征是其安全性和有效性的先决条件

干细胞来源的 EVs 可以诱导免疫细胞从激活的炎症状态转变到耐受的状态。目前有很多提高 EVs 产量的策略，如：用 N-甲基多巴胺和去甲肾上腺素可以显著提高 MCS 来源的 EVs 产量，而不影响其对免疫细胞的调节能力。但其他的物理刺激方法，例如pH、低氧等，则需要进一步评估其对EVs生理特性的影响。例如：美国食品药品监督管理局指出，2019 年在内布拉斯卡州的患者身上使用未获批准的含有 EVs 的产品进行治疗时，出现了败血症等不良反应，所以即便 EVs 安全性较高，但仍需要经过严格的质量控制以及严谨的临床监督并进行大量测试。

表2. ISEV关于EVs分离和表征的标准化

二、EVs扩增和生产

虽然 EVs 的生产可以从其他领域的成果中获益，包括蛋白质制造方面的丰富经验和细胞治疗方面不断深化的专业知识，但以下关键步骤(如图3)是 EVs 生产所特有的，因此值得特别关注。

图3. EVs生产过程中的工艺环节和关键步骤

1.EVs来源的细胞培养和表征

EVs 生产可以从传统生物制剂(即抗体和蛋白质生产)和细胞治疗的发展中获益。亲本细胞的选择和培养条件是上游工艺的关键步骤。目前，对于 EVs 生产的较佳技术还没有达成共识，仍需要根据 EVs 的活性、组织归巢特性、潜在的免疫原性以及致瘤性来选择亲本细胞。此外，遗传稳定性、宿主细胞杂质(如病原体，特别是病毒)和 EV 产量也是在亲本细胞的选择过程中需要考量的因素。一旦选好亲本细胞，就可以通过培养，产生大量具有合适表型的EVs。

关于亲本细胞的培养，建议使用的方法包括多层培养瓶，生物反应器和中空纤维筒等。对于小规模的人工生产，可以在摇瓶、转瓶、滚动瓶，细胞培养袋或生物反应器中进行细胞扩增。对于大规模的细胞培养，细胞可以生长在不锈钢生物反应器(高可达20,000L 规模)、摇杆平台细胞培养袋(高可达 500 L 规模)，甚至生物反应器(高达 2,000 L规模)。从过程安全的角度来考虑，封闭系统是优先选择；然而，这些系统比开放系统更难监控。培养过程中需要密切监测遗传漂变和污染，遵循用于生产生物制品和细胞治疗的方案。同时，越来越多的证据表明，牛奶可能是一个高效、大量获取 EVs 的来源，虽然使用牛奶 EVs 作为药物载体的可行性研究正在进行，但从复杂牛奶中大规模分离纯囊泡的方法仍然需要优化。

2. EVs药物装载方式

目前装载药物在 EVs 内部方法主要有如下两种：(本文因篇幅所限,没办法对EVs药物装载方式展开详细说明,后续官方微信公众号会有专题报道,敬请期待!)

(1)内源表达： 通过细胞内源表达，使蛋白或RNA等药物被分选进入 EVs。这种方式可以降低载药的难度，简单有效地实现药物装载。例如：Codiak 公司利用 NanoFCM 筛选出表达比例超过 95% 的PTGFRN 和 BASP1 这两个支架蛋白(如图4)，这两个蛋白几乎在所有外泌体中都有表达，实现了药物的高效递送。目前用 PTGFRN装载的 exoIL-12 是进入临床试验的工程化外泌体候选药物(2020年9月该药物进入I期临床试验，在文章投稿之后，所以没有统计在列表中)。而BASP1表达在外泌体内部，可以实现小分子药物的递送。另外，重要的是可以利用细胞自身的表达系统，源源不断地表达 IL-12，并且装载到外泌体中，利用 PTGFRN 抗体亲和纯化复杂成分的细胞上清外泌体，避免超速离心等纯化方法对外泌体的损伤，极大提高外泌体的生产效率、纯度和稳定性。

图4. Codiak公司外泌体候选药物ExoIL-12

(2)外部装载：在 EVs 纯化后，通过机械或化学技术暂时打开 EVs 的膜，使化合物扩散到囊泡中。最常见的方法包括超声、电穿孔、皂素处理和孵育等。这种载药方法比内源表达的方法复杂，且有载药效率不可控，需要去除未装载的药物等缺点。其中孵育是一种非常简单的方法，许多早期的载药方案都采用这种方法，皂苷是温和的表面活性剂，可引起膜的瞬时不稳定，从而使药物进入 EVs 中，但是后续需要去除多余的皂苷。脂质体融合也是一种载药的理想方法。(如图5)含有融合性脂质的脂质体与 EVs 孵育，使二者发生融合，可以同时发挥两种载药平台的优势，起到1+1>2 的效果。例如：2020 Advanced Science上发表的文章，在外泌体上表达 CD47 分子，使其具有免疫逃逸的功能。同时利用热敏脂质体装载抗癌药物，将两者进行融合，用 NanoFCM 测定融合效率高达 95.7%。这种复合纳米颗粒既能避免被机体免疫清除，同时又装载了治疗药物，极大地提高了治疗效果。

图5. 外泌体-脂质体融合流程

图6. 不同载药方法成本和效率对比

三、EVs纯化方法和质量监控

对于EV分离，可以通过确定的生物分离程序，包括离心、深度过滤(机械筛分和吸附)和切向流(交叉流)过滤来完成细胞中产品的初步分离。EVs 分离的方法包括：微分超速离心(dUC)、沉淀、尺寸排阻色谱、亲和层析、切向流过滤等，但是目前并没有公认的适合于大规模生产的 EVs 分离技术。主要原因是某些程序可能会对 EVs 的完整性和质量产生负面影响。同时，产量和产品纯度会因为方法和报告的不同而不同，所以总体 EVs 纯度一般都比较低。此外，对于异质性 EVs 群体，分离方法可能导致生物活性高于或低于总群体的特定亚群被选择性分离。

综上，目前亟需对不同分离方法在 EVs 回收效率、纯度、蛋白标志物、装载药物量等方面进行评价，制定统一的流程和标准。在2020年背靠背发表的两篇 JEV 文章中( Liang Dong et al., 2020， Ye Tian et al., 2020)，作者分别对不同来源的 EVs 的纯化方法进行了综合比较，意在评估不同纯化方法的优缺点，从而促进 EVs 分离纯化的标准和质量监控。其中 Liang Dong 等用 NanoFCM 对不同 EVs 分离方法进行对比，分析 EVs 大小、浓度、回收效率、纯度、表面标志物等物理、生化性质。不同的纯化方法具有各自的优势和不足，研究人员应根据样品类型、下游分析和工作场景(如临床或实验室)，在 EVs 回收率和纯度之间寻找平衡，根据样本的类型和体积，文中作者给出了相应的方案供研究者参考(如图7-图8)。文章全文使用 NanoFCM 对不同样品外泌体用不同纯化方法纯化进行了研究，NanoFCM 可在单颗粒水平对 EVs 的颗粒浓度、大小、纯度、蛋白等进行表征，研究纯化方法对EVs的影响，优化 EVs 的纯化过程，有望为建立标准有效的 EVs 分离和质控方法提供表征手段。

图7. EVs表面标志物蛋白分析

图8. 不同来源EVs纯化方法选择

四、总结和展望

从监管的角度来看，EVs 属于生物制剂的制药类别(根据不同地区的说法，分别被称为生物药物、生物制剂或生物制药)，包含一种或多种由生物细胞制成或从生物细胞中提取的活性物质。一般而言，生物制剂中的活性物质要比非生物制剂中的活性物质复杂。目前这种复杂的物质和结构只能由活的生物体产生。然而，这种生产方法本质上面临着一定程度的内在生物变异，这可能导致不同批次间产品的异质性。

从工艺设计的角度来看，这种异质性既受到用于表达生物制剂的细胞内生物工艺(上游加工)的影响，也受到用于生产生物制剂的制造工艺(下游加工)的影响。值得注意的是，培养条件：如细胞传代、细胞密度和EVs 收获频率，极大地影响产品质量，包括产量、EVs 组成和 EVs 的生物活性等。生产条件的微小变化可能会对EVs产品质量和活性产生相当大的影响，所以这些细微条件的改进均需要一种在单颗粒水平，快速、高通量检测的方法来进行质量监控。

纳米流式检测仪(NanoFCM)可在单颗粒水平，对 40-1000 nm的EVs进行单颗粒分析，测定 EVs 的颗粒浓度、粒径分布、载药量、蛋白、核酸等物理生化性质，对 EVs 的生产过程进行质量控制，优化生产条件、提高载药效率。同时可对 EVs 在生产后的稳定性进行评价，评估不同存储条件对 EVs 的影响，NanoFCM 的应用贯穿整个药物研发、生产、质控、稳定性评估等整个过程，极大加快 EVs 药物研发的进程！

¹EVOX发展了名为DeliverEXTM的外泌体递送平台，此平台可以设计和修饰外泌体，并将蛋白、RNA及其他类型的药物加载到外泌体中，使其具有靶向目标组织的功能，将药物递送到靶器官中。借助于DeliverEXTM平台，EVOX在2020年分别与制药巨头武田和礼来达成了巨额的合作协议(分别为8.82亿美元和12亿美元)，将其外泌体技术应用于递送蛋白质或RNA，从而实现罕见病和神经系统疾病的治疗，维持制药巨头在各自领域的优势。

参考文献：