eLife | 食管癌诊断的生物标志物筛选

Author: Mika Huang     Date: March 28, 2024

食管癌(esophageal cancer, EC)是全球排名第七的恶性肿瘤，在癌症致死原因中排名第六，每年导致超过50万名患者死亡。EC具有易转移和易复发的特性，尽早发现并及时干预对于提高EC生存率具有重要意义。因而，迫切需要开发一种直接、有效且无创的诊断方法，从而优化疾病筛查流程。

目前主流的EC诊断方法如影像学技术、组织活检和血清肿瘤标记物，包括癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)和CA-199等。影像学技术在检测小病灶方面灵敏度有限，但它仍然是癌症诊断和监测的首要方法，对复发部位的早期检测面临严峻挑战。另一方面，血清标志物对早期诊断和复发检测的灵敏度和特异性均比较低。因此，亟需寻找更有效的EC诊断标志物来加强疾病的早期筛查和无创诊断。

细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是由细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性小囊泡，几乎所有的细胞都可以分泌EVs，EVs携带来自亲本细胞丰富的生物大分子信息，在人体血液、尿液、羊水、唾液等体液中均有分布，具备成为诊断标志物的优良特性。研究发现，肿瘤患者来源的小细胞外囊泡(small extracellular vesicles, sEVs)的蛋白表达与健康供体(healthy donors, HD)存在显著差异，因此，这些差异表达的sEVs蛋白有望成为潜在的肿瘤诊断生物标志物。CD54是细胞内粘附分子-1，是免疫球蛋白超家族中的一种跨膜糖蛋白，存在于多种细胞类型中，并在对多种炎症介质的反应中上调。在乳腺癌、胃癌和结直肠癌等肿瘤中发现CD54高表达现象，而有关外泌体CD54在EC中的研究并未见报道。

赣南医学院附属第一医院的学者们在eLife杂志上发表了题为"Tissue-derived exosome proteomics identifies promising diagnostic biomarkers for esophageal cancer"的文章，作者利用质谱方法分别对EC患者的癌症组织和癌旁组织来源的外泌体进行了蛋白质组学分析，筛选表达差异化的蛋白，并在122例EC患者的血浆外泌体中进行了验证。结果表明CD54是一种EC早期诊断很有前景的潜在生物标志物，也是疾病进程中的关键分子。

研究工作流程如图1所示，包括对癌症组织和癌旁组织的外泌体分离、鉴定以及对其全面的蛋白质组学分析。此外，图1还展示了纳米流式检测技术(nano-flow cytometry, NanoFCM)的EVs粒径表征结果、电镜提供的形貌表征以及蛋白免疫印迹(western blot, WB)的阴(GM130)/阳性(CD9/CD63/TSG101)蛋白表达情况，符合MISEV2018对EV的表征要求。

图1. 外泌体鉴定

CD54在癌症及癌旁组织的表达分析

对8组癌症和癌旁组织来源的外泌体进行了无标记定量蛋白质组学分析，发现803个差异表达蛋白，其中686个表达上调，117个表达下调，且两种组织来源的外泌体蛋白质组存在显著差异。值得注意的是，以上8组外泌体样品蛋白组学分析显示CD54表达上调。使用免疫组化、RT-qPCR和western blot等方法进一步验证（如图2所示），发现癌症组织来源的sEVs的CD54显著高表达，且高于癌旁组织来源的sEVs，该结果与蛋白质组学的分析结果一致。

图2. CD54在食管癌(EC)组织中表达上调

CD54在血浆外泌体中的表达

临床上常以血浆作为样品来源，随后在多个患者的血浆样本上验证CD54的表达情况，用超离法提取122例EC患者和62例健康患者(Health donor, HD)的血浆外泌体。用纳米流式(NanoFCM)分析血浆EVs中CD54的阳性率，结果如图3A-C所示，EC组血浆EVs中CD54阳性率为17.3%，HD组为10.6%，EC组整体水平显著高于健康患者。对于EC组进行临床分期后发现， CD54阳性率在临床的Ⅲ-Ⅳ期显著高于临床Ⅰ-Ⅱ期（图3D），再次确认了CD54在疾病进展中作为标志物的可行性。此外，跟踪12个EC患者术前和术后CD54的表达情况，如图5E所示，术后CD54表达水平显著下降，NanoFCM的结果为CD54在疾病诊断和预后监测的潜力提供数据支撑。

图3. 血浆外泌体中CD54的表达

此外，ROC曲线分析结果显示，外泌体CD54对EC的诊断敏感性、特异性和AUC分别为66.13%、71.31%和0.702。且对肿瘤大小>4cm患者的诊断表现(AUC=0.761)优于小于4cm(AUC=0.600)的患者。临床分期的AUC结果也显示，Ⅲ和Ⅳ期显著高于Ⅰ和Ⅱ期。

图4. 血浆外泌体CD54在食管癌(EC)诊断中的疗效

综上，作者通过组织来源外泌体水平分析发现高/低表达的候选蛋白标志物CD54，随后利用NanoFCM通过EC患者的血浆样本验证了这一发现。一系列的验证结果表明，外泌体CD54有望作为EC的潜在诊断标志物。同时，作者也提到，本研究的样本量有限，需要更多的临床样本研究结果以确定外泌体CD54在EC诊断中的有效性。

NanoFCM展望

NanoFCM以其超高散射和荧光灵敏度等优势，在单颗粒水平验证了外泌体低丰度表达蛋白的表达情况，与蛋白组学等宏观分析方法形成上下游解决方案，在液体活检领域具有广泛的应用。高效的外泌体分离纯化对于下游研究应用至关重要，我司致力于提供完善的外泌体上下游解决方案，于2023年7月推出EVMag外泌体纯化&标记试剂盒，具有特异性好，得率高、纯度高、操作简单等优势，可极大帮助和提升研究者们获取更高质量的外泌体样本（具体详见往期文章：EVMag纯化试剂盒新品来袭），感兴趣的老师可以扫描下方二维码咨询。